肝細(xì)胞癌CpG島甲基化表型的研究.pdf

1、本文研究目的：運用甲基化特異性PCR方法檢測肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中OPCML、p15、SOCS-1、GST-p、RAR-b、p16、p73、p14、MGMT并口hMLH1基因的甲基化狀況，旨在探討肝癌中是否也存在CpG島甲基化表型，以及CpG島甲基化表型和OPCML基因與肝癌的發(fā)生和預(yù)后是否有關(guān)。 材料收集：1998年11月～2003年11月年中山大學(xué)腫瘤防治中心肝膽外科手術(shù)切除的標(biāo)本。其中合并門靜脈主干或一級分支癌栓的病例2

2、3例，并隨機(jī)選擇同期未合并門靜脈主干或一級分支癌栓的病例27例，共50例腫瘤樣本，相應(yīng)的癌旁組織48例。 研究方法： 1.本研究利用甲基化特異性PCR(MS-PCR)技術(shù)檢測肝癌及其癌旁組織中OPCML，MGMT，RAR-b，hMLH1，GST-p，p14，p15，p16，p73，SOCS-1等10個基因的甲基化情況。 DNA亞硫酸修飾：按照Herman(10)介紹的方法進(jìn)行DNA亞硫酸修飾。2μgDNA溶于50

3、μl水中，加入NaOH(終末濃度為0.2mol/L)，37℃變性10min；然后加入30μl10mmol/L的氫醌和520μl3mol/L的亞硫酸氫鈉(pH5.0)，混勻后加礦物油于50C孵育16h。應(yīng)用WizardDNA純化柱純化修飾DNA；純化后的DNA再用NaOH(終末濃度未0.3mol/L)于室溫下處理5min，乙醇沉淀，回收沉淀的DNA溶于50μl水中-80℃儲存?zhèn)溆?。每輪PCR反應(yīng)需2μl修飾的DNA做模板。 MSP

4、：特異性CpG甲基化狀態(tài)運用MSP方法(DNA經(jīng)過亞硫酸修飾，設(shè)計特異性擴(kuò)增甲基化和非甲基化DNA序列的引物)來檢測。亞硫酸處理DNA，能使所有的未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)因?qū)Υ颂幚頍o效而仍為胞嘧啶。因此，經(jīng)過處理以后，甲基化與非甲基化的DNA具有不同的序列。從而根據(jù)甲基化和非甲基化DNA單鏈序列的差異來設(shè)計不同的PCR引物。通過PCR擴(kuò)增甲基化或非甲基化DNA單鏈及對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳即可以判斷

5、所取標(biāo)本的基因甲基化狀態(tài)。p14，p15，p16，p73，MGMT，OPCML，SOCS-1，RAR-b，GST-pandhMLH1的甲基化狀態(tài)運用MSP(10)方法來檢測。 2.病例入選標(biāo)準(zhǔn)：1998年-2003年我院肝膽科手術(shù)切除標(biāo)本；由我院病理確診為HCC病例；隨訪資料完整； 3.實驗分組：肝癌組50例(癌栓組23例，無癌栓組27例)，對應(yīng)癌旁腫瘤組織：48例 研究結(jié)果：肝癌組織甲基化率普遍比相應(yīng)癌旁組織甲

6、基化率高：OPCML(70.0％vs64.6％)、p15(58.0％vs50.0％)、SOCS-1(78.0％vs50.0％)、GST-p(56.0％vs27.1％)、RAR-b(30.0％vs6.3％)、p16(26.0％vs14.6％)、p73(16.0％vs0％)、p14(36.0vs27.1％)、MGMT(16.0％vs10.4％)和hMLH1(18.0％vs4.2％)。SOCS-1，GST-p，RAR-b，p16和p73基因甲

7、基化率在肝癌組與癌旁組差異有顯著性(P＜0.05)，其它基因兩組之間的甲基化率差異無顯著性。CIMP陽性組(同時具有≥3個位點甲基化)復(fù)發(fā)時間較早，一年無瘤生存率為18.2％，而CIMP陰性組(具有≤2個位點甲基化)復(fù)發(fā)時間較晚，一年無瘤生存率為75.0％(P＜0.05)。p15、p73、hMLH1、MGMT、RAR-b、GST-p、SOCS-1基因在癌栓組中的甲基化率比無癌栓組高，但未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 研究