八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白在溶液中的聚集性質(zhì)研究.pdf

1、中心蛋白(Centrin)是屬于EF-hand鈣結(jié)合蛋白超家族的分子量較小(約20kD)的酸性蛋白。最初中心蛋白是作為鞭毛單細(xì)胞生物中連接核和鞭毛器的纖維的主要成分被鑒定得到的，隨后發(fā)現(xiàn)中心蛋白是中心粒，中心體和有絲分裂紡錘體極體中一種廣泛存在的成分，與細(xì)胞的分裂，細(xì)胞中中心體的定位、定向，紡錘體極體分離，微管切除，纖維系統(tǒng)的收縮等有關(guān)。其中基于中心蛋白的纖維系統(tǒng)的收縮現(xiàn)象，與在Ca2+存在下，不論是酵母，藻類(lèi)或是人類(lèi)的中心蛋白都會(huì)形成

2、多聚體密切相關(guān)。
　　八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白(EoCen)是從一種在進(jìn)化上處于特殊地位的單細(xì)胞真核生物——八肋游仆蟲(chóng)中克隆得到的，將其作為研究金屬離子(Ca2+、Ln3+)進(jìn)入體內(nèi)的靶蛋白模型，對(duì)于闡明稀土生物效應(yīng)的分子基礎(chǔ)具有重要的意義。EoCen共含有168個(gè)氨基酸殘基，與人中心蛋白1(HsCen1)，人中心蛋白2(HsCen2)和人中心蛋白3(HsCen3)的序列同源性分別為60％，62％和66％，與研究最為廣泛的EF-hand

3、結(jié)構(gòu)蛋白鈣調(diào)蛋白(CaM)的同源性為50％。最近，八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端結(jié)構(gòu)域的NMR結(jié)構(gòu)剛剛被報(bào)道(2joj.pdb)。與CaM一樣，EoCen由兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，中間由一段彈性螺旋相連。每個(gè)結(jié)構(gòu)域都由一對(duì)螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)的EF-hand結(jié)構(gòu)基元組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)基元能夠結(jié)合一個(gè)Ca2+。與其他物種的中心蛋白一樣，在Ca2+存在下，EoCen也會(huì)形成多聚體，這一點(diǎn)與CaM明顯不同。本文將著重研究金屬離子誘導(dǎo)下八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白在

4、溶液中的聚集性質(zhì)。
　　本文用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建得到了九個(gè)酪氨酸突變體(Y46F, Y72F,Y79F, N-Y46F, N-Y72F, N-Y79F, N-Tyr46，N-Tyr72，N-Tyr79)重組質(zhì)粒。通過(guò)DNA序列分析確定所得到的突變體只含有目的位點(diǎn)的突變基因，而不包含其它任何位點(diǎn)的隨機(jī)突變。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，在誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)蛋白可溶性表達(dá)。融合蛋白經(jīng)PPase酶切和GST親和層

5、析之后得到目的蛋白。另外，將野生型蛋白(EoCen)和本課題組之前構(gòu)建完成的蛋白片段分子(N-EoCen，C-EoCen，△23EoCen，P23，P123)誘導(dǎo)表達(dá)純化得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示所有蛋白均不含雜蛋白條帶，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需純度。
　　首先對(duì)金屬離子誘導(dǎo)下的EoCen的聚集性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析表征。含有不同結(jié)構(gòu)域的蛋白片段分子(EoCen，N-EoCen，C-EoCen，△23EoCen，P23，P123)

6、的化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)表明蛋白的N末端是聚集發(fā)生的主要部位。天然膠電泳顯示在Lu3+存在下，只有完整的野生型蛋白分子能夠顯示出多聚體條帶。用共振光散射(RLS)的方法分析了多種理化因素，包括溫度，蛋白濃度，離子強(qiáng)度，酸度對(duì)Lu3+誘導(dǎo)的EoCen聚集性質(zhì)的影響。不同金屬離子與蛋白結(jié)合的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，Lu3+或Ca2+在EoCen N端的結(jié)合有利于蛋白的聚集，且Lu3+表現(xiàn)出更強(qiáng)的促進(jìn)效應(yīng)，而Mg2+的結(jié)合不能起到相同或相似的作用。2-ptolu

7、idinylnaphthalene-6-sulfonate(TNS)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及離子強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)證明Lu3+結(jié)合誘導(dǎo)的EoCen的聚集與蛋白疏水區(qū)的暴露密切相關(guān)。酸度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，不同片段分子蛋白的對(duì)照研究表明靜電作用在EoCen的聚集過(guò)程中影響較小。
　　酪氨酸殘基是組成蛋白——蛋白相互作用的“熱點(diǎn)”區(qū)域的主要氨基酸殘基之一，且其具備發(fā)光性質(zhì)。本課題組之前的工作以Tb3+作為熒光探針證明EoCen存在4個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，且Tb3+敏

8、化熒光的增強(qiáng)主要來(lái)源于EoCen的N末端所含的三個(gè)酪氨酸殘基（Tyr-46，Tyr-72，Tyr-79）與結(jié)合的Tb3+之間的能量轉(zhuǎn)移。為了找到EoCen聚集時(shí)的蛋白——蛋白相互作用過(guò)程中，以及EoCen與Tb3+結(jié)合時(shí)的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用的酪氨酸殘基，本文用定點(diǎn)突變的方法得到了九個(gè)分別含有一個(gè)或兩個(gè)酪氨酸殘基的EoCen突變體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示79位酪氨酸的突變對(duì)熒光敏化的影響最為明顯，使得Tb3+的熒光敏化強(qiáng)度降低達(dá)到50％之多。

9、F(o)rster能量轉(zhuǎn)移機(jī)理得出79位酪氨酸與蛋白N端結(jié)合的兩個(gè)Tb3+之間的距離最近(8.8±0.2(A))。穩(wěn)態(tài)熒光及時(shí)間分辨熒光參數(shù)的測(cè)定表明處于疏水環(huán)境中的Tyr-79量子產(chǎn)率最高(3.27×10-2)，熒光壽命相對(duì)較長(zhǎng)(2.20 ns)，且平均壽命數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ=0.271 ns)最小。另外，分子模擬顯示Tyr-79的酚羥基與Asn-39的側(cè)鏈上的氧原子之間形成了重要的氫鍵。酪氨酸與Tb3+的熒光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明酪氨酸熒光

10、的猝滅絕大部分來(lái)源于EoCen在金屬離子結(jié)合誘導(dǎo)下產(chǎn)生的聚集，研究發(fā)現(xiàn)不同酪氨酸突變體所表現(xiàn)出的熒光猝滅程度有所不同。以全分子單酪氨酸突變體(Y46F，Y72F，Y79F)為研究對(duì)象，經(jīng)RLS和化學(xué)交聯(lián)分析顯示，Tyr-79是蛋白聚集過(guò)程中貢獻(xiàn)最大的酪氨酸殘基。
　　細(xì)胞滲透型小分子抑制劑Monastrol通常被認(rèn)為能夠特異性地抑制驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5的活性，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂停滯和單極紡錘體的形成，從而表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。中心蛋白作

11、為一種附著于中心體上的廣泛存在的蛋白，在中心體復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。已有報(bào)道稱(chēng)中心體的大量增殖很可能與癌癥有關(guān)。本文研究發(fā)現(xiàn)Monastrol在體內(nèi)能夠有效抑制轉(zhuǎn)化有pGEX-6p-1-EoCen重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及八肋游仆蟲(chóng)的增殖分裂;在體外能夠抑制Lu3+誘導(dǎo)的EoCen的聚集。合成得到的兩個(gè)Monastrol類(lèi)似物（Compound1和Compound2）不能達(dá)到相同的抑制效果。熒光滴定實(shí)驗(yàn)表明1個(gè)EoCen蛋

12、白分子能夠結(jié)合4個(gè)Monastrol分子，并且得到不同溫度下EoCen與Monastrol相互作用的結(jié)合常數(shù)。熱力學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示EoCen與Monastrol結(jié)合的主導(dǎo)作用力為疏水作用力。Monastrol對(duì)蛋白聚集抑制的程度與金屬離子結(jié)合所誘導(dǎo)的蛋白疏水區(qū)的暴露密切相關(guān)。
　　蜂毒素(Melittin)是一種從蜂毒中提取出的由26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的兩親性小分子肽，被廣泛用作研究蛋白——蛋白相互作用或者蛋白—脂類(lèi)相互作用的工具。本