嗜熱酯酶Est11的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及其在糖酯合成中的應(yīng)用研究.pdf

1、酯酶（carboxylesterases，carboxyl ester hydrolases，EC3.1.1.1）可催化酯交換、酯合成、多肽合成和內(nèi)酯合成等多種反應(yīng)，在食品、化工和環(huán)保等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。嗜熱酯酶與常溫酯酶相比，表現(xiàn)出較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和抗有機(jī)溶劑等性能，因此在生物催化合成等領(lǐng)域極具應(yīng)用潛能。本研究首先將來(lái)自嗜熱古菌海棲熱胞菌MSB8（Thermotoga maritima MSB8）中表達(dá)酯酶的基因 Tm1350在大腸桿

2、菌中克隆表達(dá)，得到嗜熱酯酶Est11，然后對(duì)嗜熱酯酶Est11的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，最后對(duì)該嗜熱酯酶Est11在催化合成糖酯方面進(jìn)行了探究。
　　具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）生物信息學(xué)分析表明，T.maritima MSB8全基因組中Tm1350酯酶基因全長(zhǎng)為780 bp，對(duì)應(yīng)編碼259個(gè)氨基酸。利用Blast軟件找到氨基酸同源序列，并利用同源序列分析軟件Clustal W對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ser103、

3、Asp183和His249可能是Tm1350酯酶的催化活性中心。
　?。?）采用重疊 PCR方法克隆嗜熱酯酶基因 Tm1350，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-Tm1350，將重組質(zhì)粒pET15b-Tm1350轉(zhuǎn)化至Escherichia.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建宿主工程菌，重組基因工程菌E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白酶Est11，SDS-PAGE結(jié)果顯示該目的蛋白Est11分子量約28 KDa，

4、鎳柱親和層析純化法所得Est11純化回收率達(dá)到27.13％，Est11比活力為993.05 U/mg。
　　（3）嗜熱酯酶Est11的酶學(xué)性質(zhì)研究表明：（a）酯酶Est11的最適作用溫度和最適pH分別為70℃和6.5。酯酶Est11具有較高的熱穩(wěn)定性，90℃高溫下處理5 h仍有60%以上的殘余酶活。（b）底物特異性分析表明嗜熱酯酶Est11適宜水解碳鏈長(zhǎng)度小于10的對(duì)硝基苯酚酯，且其最適水解底物為pNP-C5。（c）0.5 mM金

5、屬陽(yáng)離子螯合劑EDTA、Ba2+和Mg2+對(duì)嗜熱酯酶Est11酶活性無(wú)顯著影響；Na+和K+能將嗜熱酯酶Est11的酶活性提高約20%；Ni2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+和Pb2+使嗜熱酯酶Est11酶活性降低約50%；Cu2+明顯抑制嗜熱酯酶Est11的酶活，使其酶活力僅剩14%；Al3+則完全抑制嗜熱酯酶Est11酶活性。（d）該嗜熱酯酶Est11具有較強(qiáng)的抵抗有機(jī)溶劑能力，Est11在90%的DMSO、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑體系

6、中處理2 h，酶活性無(wú)明顯變化，而在90%的叔戊醇、氯仿、二氯甲烷等有機(jī)溶劑體系中仍有約50%酶活。（e）嗜熱酯酶Est11在離子液體中酶活性降低，如在50%離子液體N-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸鹽中處理2 h酶活性僅剩60%。（f）SDS、Tween-20等對(duì)嗜熱酯酶Est11酶活性無(wú)顯著影響。5 mM DTT和PMSF使嗜熱酯酶Est11酶活性分別降為原來(lái)的13%和51%，5 mM DEPC則完全抑制Est11酶活性。（g）傅里葉紅