嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)與性質(zhì)研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是地球上含量僅次于纖維素、位居第二的碳水化合物,而真菌所分泌的幾丁質(zhì)酶可將幾丁質(zhì)水解,最終產(chǎn)物為N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-Acetyl-β-D-Glucosamine,NAG)。 由于采用傳統(tǒng)化學(xué)方法降解幾丁質(zhì)耗時(shí)、難度大、成本高、污染嚴(yán)重,而采用生物降解不僅有效克服了上述問題,還可提高資源利用、增加經(jīng)濟(jì)效益,因此被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境等諸多領(lǐng)域。 盡管已經(jīng)分離了許多種幾丁質(zhì)酶,相關(guān)的基因也

2、已克隆和表達(dá),但有關(guān)熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶的研究卻很少。目前僅從極端耐熱古細(xì)菌Thermococcus chitonophagus、Thermococcus kodakaraensis KOD1以及細(xì)菌Bacillus BG-11、Streptomyces OPC520等中分離到熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因,而真菌中除了本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的來源于嗜熱真菌疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因外,未見其它報(bào)道。

3、 嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum)廣泛分布,生長上限溫度較高,從該真菌中已分離得到多種嗜熱酶,但未見嗜熱幾丁質(zhì)酶的報(bào)道。本研究中C. thermophilum在以膠狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生了胞內(nèi)幾丁質(zhì)酶。 根據(jù)真菌幾丁質(zhì)酶的氨基酸同源保守序列設(shè)計(jì)簡并引物,通過RT-PCR及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了嗜熱毛殼菌C.thermophilum熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶chit基

4、因,cDNA序列全長為1209bp,包含-個(gè)開放閱讀框,編碼402個(gè)氨基酸。該基因已在Genbank中注冊,登錄號(hào)為EU697741。同時(shí)提取出嗜熱毛殼菌C. thermophilum基因組DNA,克隆了該酶的部分DNA序列,獲得的序列長1263bp,包含一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。該基因在GenBank中注冊號(hào)為EU697742。 由核苷酸序列推測的相應(yīng)氨基酸序列結(jié)構(gòu)包括催化區(qū),無N端信號(hào)肽序列、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和富含絲蘇氨酸區(qū)。比較幾丁質(zhì)酶

5、的催化區(qū)序列,發(fā)現(xiàn)與18家族幾丁質(zhì)酶的催化區(qū)同源性很高,其中兩個(gè)基序S-GGW和DG-D-DWE非常保守,這兩保守基序與糖基水解酶(glycosylhydrolases)18家族催化活性有關(guān),其中不變氨基酸殘基Asp和Glu為幾丁質(zhì)酶的催化活性位點(diǎn),因此該酶應(yīng)屬于幾丁質(zhì)酶18家族。還利用在線軟件預(yù)測了該蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。并對該基因的系統(tǒng)發(fā)育作了初步分析。 將chit基因與酵母表達(dá)載體pPIC9K經(jīng)EcoR I和Not

6、 I雙酶切后,體外連接構(gòu)建了酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K/chit,將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/chit和pPIC9K空質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Sac I(位于5’AOX1區(qū)內(nèi))線性化后,采用電擊法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞,于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測及G418抗性篩選多拷貝整合子,進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過檢測各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來篩選高效

7、表達(dá)目的幾丁質(zhì)酶的工程菌株。經(jīng)過檢測與篩選獲得了轉(zhuǎn)酵母工程菌株GS-CH-4,檢測遺傳穩(wěn)定性,并測定了幾丁質(zhì)酶CHIT的酶學(xué)性質(zhì)。 酵母工程菌株GS-CH-4在YPD平板上劃線,連續(xù)傳代8次后,PCR檢測呈陽性,重組幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量基本保持穩(wěn)定。表達(dá)幾丁質(zhì)酶CHIT的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和5.5,該酶在50℃以下穩(wěn)定；65℃的半衰期為40min,由此可見該表達(dá)幾丁質(zhì)酶具有熱穩(wěn)定性,且在pH值為2.0～6.0之間表達(dá)幾丁