15391.羧酸酯酶基因的克隆表達(dá)及其應(yīng)用

1、分類號：——UDC——密級：盟編號：羧酸酯酶基因的克隆表達(dá)及其應(yīng)用Cloning&ExpressionandApplicationofCarboxylesteraseGene學(xué)位授予單位及代碼：基查理王盔堂!!Q!晝魚2學(xué)科專業(yè)名稱及代碼：玉扭絲堂(QZQ圣Q12研究方向：玉扭生塑麴苤撾抖申請學(xué)位級別：亟指導(dǎo)教師：王遮坐塾援研究生：圃』!蟲論文起止時(shí)間：201110一201212摘要本文實(shí)現(xiàn)了小鼠肝臟羧酸酯酶的基因克隆表達(dá)，并對重組酶的

2、酶學(xué)性質(zhì)和降解作用進(jìn)行研究。提取小鼠肝臟總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆羧酸酯酶基因(ceslf)，與pUCmT載體連接，構(gòu)建克隆載體pUCmTceslf。測序正確后，將ceslf亞克隆至表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aceslf，轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE電泳結(jié)果顯示出分子質(zhì)量約為77KD的特異性條帶，但主要以包涵體形式存在。優(yōu)化表達(dá)條件，確定最優(yōu)條件為：pH65，20℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)

3、接量3：200，IPTG終濃度06mM，誘導(dǎo)8h。采用Ni柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的可溶性蛋白酶比活為5537U／mg，純化回收率為478％。分別以洳乙酸萘酯和B乙酸萘酯作為底物測定重組羧酸酯酶的Km值分別為：006125mM和01334mM，確定最適底物為渺乙酸萘酯。重組酶最適溫度為27℃，最適pH在60到80之間。利用重組酶對農(nóng)藥進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)對西維因、呋喃丹、甲基對硫磷及聯(lián)苯菊酯等具有降解作用，為環(huán)境中農(nóng)藥殘