人iPSCs誘導(dǎo)體系的優(yōu)化.pdf

1、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是干細(xì)胞領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，它具有胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)的特性并且完全避免了ESCs研究應(yīng)用所面臨的倫理及技術(shù)上的雙重困境。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)了人胎兒成纖維細(xì)胞(human fetus fibroblast cells, hFFCs)，對(duì)其培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化；對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEYK·E4進(jìn)行了鑒定，優(yōu)化了

2、其轉(zhuǎn)染條件以包裝出高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；體外培養(yǎng)了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonal fibroblasts, MEFs)并摸索由其制備飼養(yǎng)層的最佳條件；使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 hFFCs后觀察其因目的基因的作用而發(fā)生的變化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)人iPSCs的誘導(dǎo)體系進(jìn)行了整體性的優(yōu)化，具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　使用單細(xì)胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)了 hFFCs，并對(duì)其體外培養(yǎng)體系(培養(yǎng)基類型、胎牛血清濃度、堿性成纖細(xì)細(xì)胞

3、生長因子)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，由組織塊培法原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更好，傳代后極少出現(xiàn)未貼壁的死細(xì)胞；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、8％ FBS、10 ng/mL bFGF為hFFCs培養(yǎng)的最佳條件，此條件下培養(yǎng)由組織塊培養(yǎng)法原代獲取的hFFCs細(xì)胞形態(tài)良好、增殖能力強(qiáng)，群體倍增時(shí)間短(19.3 h左右)，冷凍后仍能保持很好生物學(xué)特性，適合作為目的細(xì)胞以誘導(dǎo)成為iPSCs。
　　采用限制酶酶切、PCR、測(cè)序等方法對(duì)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pEY

4、K·E4進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，pEYK·E4基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pEYK3.1構(gòu)建，包含 c-myc、Klf4、Sox2、Oct4四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，大小為8228 bp。隨后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)和磷酸鈣介導(dǎo)的方法于293T細(xì)胞中對(duì) pEYK·E4進(jìn)行病毒包裝并測(cè)定滴度，并以影響磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的三個(gè)因素(293T細(xì)胞的接種密度、質(zhì)粒DNA的量、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境CO2濃度)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)摸索最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果表明，磷酸鈣介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，最佳條件為

5、293T細(xì)胞的接種密度為5×105個(gè)/mL、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境CO2濃度為3%、質(zhì)粒DNA的量為30μg，獲得的病毒滴度為1.9×104 CFU/mL；脂質(zhì)體法所獲得的病毒滴度為4×104 CFU/mL。
　　使用單細(xì)胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)MEFs，對(duì)絲裂霉素C處理MEFs制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的濃度和處理時(shí)間進(jìn)行摸索。結(jié)果表明，制備飼養(yǎng)層時(shí)最佳條件為10μg/mL的絲裂霉素C處理MEFs2 h。
　　將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染兩次的hFF