DMD基因診斷體系建立、應用和羊水iPSCs構建.pdf

1、假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy/Becker's MuscularDystrophy，DMD/BMD)是最常見的X-連鎖隱性致死性遺傳病之一，由Duchenne等（1868年）首先報道，故得其名。本病的群體發(fā)病率高達1/3500活產(chǎn)男嬰，是一種預后不良的常見的原發(fā)性肌肉疾病。典型的臨床特征是進行性肌萎縮、肌無力伴小腿腓腸肌的假性肥大，通常累及青少年男性，一般在12歲以前喪失站立和行走的能力，

2、最后因心肌以及呼吸肌無力而多于20歲前死于心力衰竭或呼吸衰竭。本病嚴重影響了青少年男性的健康成長，同時也給家庭和社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔。
　　 本病基因定位在人類X染色體短臂Xp21上，DMD基因突變是本病各型臨床亞型患者發(fā)病的共同的分子遺傳學基礎。DMD基因突變的主要形式有三類:缺失型突變、重復型突變和點突變，前兩種突變約占了全部基因突變的70％，點突變約占30％。而所有的突變中約70％遺傳自母親，約30％沒有家族史，

3、為新發(fā)突變。
　　 國內外至今尚缺乏對于本病有效的治療措施，因此，對先證者進行確診、對攜帶者進行產(chǎn)前診斷以杜絕患兒出生的出生缺陷干預措施仍然是目前國內外假肥大型肌營養(yǎng)不良癥遺傳優(yōu)生關鍵之所在。
　　 在基因診斷技術開展以前，本病的臨床診斷除依靠典型的癥狀和體征外，還需要結合肌電圖、酶生化檢查和肌肉活檢等輔助性檢查，其中肌電圖顯示肌源性損害及酶生化檢查發(fā)現(xiàn)肌酶活性顯著增高是較可靠的臨床診斷依據(jù)。但上述血清酶的增加特異性并不

4、高，并且存在假陽性和假陰性，而且不能應用在胎兒的產(chǎn)前診斷上，導致在臨床上應用受到一定的限制。
　　 隨著DNA研究技術的發(fā)展，各種基因診斷的手段也被應用到假肥大型肌營養(yǎng)不良癥的檢測中來。國外DMD基因診斷的主要手段有:Southern印跡雜交技術、DMD基因多重PCR技術、短串聯(lián)重復序列PCR技術及反轉錄PCR技術。Chamberlain等設計了9對引物的多重PCR，可檢出80％的DMD基因缺失型患者;Beggs等增設了另外9對

5、引物多重PCR，這18對引物總共可以檢出98％的DMD基因缺失型患者。但這種方法的局限是不能檢測出基因缺失型和基因重復型的雜合子攜帶者。Prior等最先應用定量PCR原理診斷了雜合子攜帶者。短串聯(lián)重復序列PCR技術也被用于非缺失型家系的基因連鎖分析。
　　 DMD產(chǎn)前基因診斷是一個比較復雜的難題，我們以前主要采用性別診斷、多重PCR缺失突變分析、STR單體型連鎖分析等方法進行。這些方法有一定的局限性，不能很好地適應產(chǎn)前診斷的需要

6、。單一的性別診斷會導致正常的男性胎兒被淘汰掉。由于存在高達11％的基因內交換率，理論上STR單體型連鎖分析結果具有可高達11％假陽性或假陰性率，因此，這種單體型連鎖分析診斷結果只是一種概率性診斷，有時也因缺乏先證者和雜合信息或家系過小而無法展開連鎖分析。多重PCR方法所得到的遺傳信息量不夠大，容易導致漏診，而且不能檢測出重復突變，也不能檢測出雜合子攜帶者。鑒于上述缺陷，建立各種DMD基因雜合子非概率性確診技術就成為最終解決DMD雜合子攜

7、帶者診斷的關鍵，是DMD產(chǎn)前基因診斷的前提條件。
　　 針對DMD基因三大類突變類型，我們擬建立高效、省時的針對DMD基因全部79個外顯子的缺失型、重復型和點突變型基因突變的檢測方法，對患者以及攜帶者作出正確的診斷，并將其應用于產(chǎn)前診斷;探索產(chǎn)前診斷時機前移的可行性，以達到早期診斷、杜絕患胎出生、優(yōu)生優(yōu)育的目的。
　　 本研究應用多重連接依賴性探針擴增（Multiplex Ligation dependent Probe

8、Amplification，MLPA）等方法對DMD先證者及其母親進行檢測，篩選出準備生育下一胎的DMD攜帶者進行產(chǎn)前基因診斷，檢測DMD全部79個外顯子的缺失型與重復型突變，建立準確的DMD患者和雜合子攜帶者的基因診斷技術;建立改良的96孔板一步全外顯子測序方法，用于點突變型DMD基因突變的檢測和產(chǎn)前診斷;摸索高分辨溶解曲線(High Resolution Melting，HRM)用于DMD突變的初篩方法;摸索單卵裂球的全基因組擴增方

9、法，為下一步開展胚胎種植前遺傳學診斷和篩查(PGD/PGS)、囊胚優(yōu)化提供實驗準備;探討女性DMD患者的發(fā)病機理;建立羊水來源細胞誘導多能干細胞系(iPSCs)，為DMD的基因治療研究和疾病模型建立提供良好的研究基礎。
　　 第一章、缺失型和重復型DMD基因突變診斷技術的建立及其在產(chǎn)期診斷中的應用研究
　　 目的：本部分的研究目的在于建立更準確、高效、省時的基因診斷方法應用于缺失型和重復型DMD基因突變的診斷和產(chǎn)前診斷。

10、
　　 建立適宜的實驗方法篩查DMD全部79個外顯子的缺失與重復突變。建立準確的DMD患者和雜合子攜帶者的基因診斷技術。在前期研究基礎上，篩選出準備生育下一胎的DMD家系進行產(chǎn)前基因診斷，避免以往正常的男性胎兒被無辜地淘汰掉的情況發(fā)生，建立一套臨床可行的DMD產(chǎn)前基因診斷方法。
　　 本章研究還探討早期產(chǎn)前診斷的方法與時機，盡量把檢測時機提早，從中期羊水檢查提早到早期絨毛的產(chǎn)前診斷，便于終止妊娠手術的提前，減輕孕婦的痛苦

11、，為出生缺陷的早期干預提供實驗基礎。
　　 對單卵裂球進行DNA全基因組擴增，摸索可用于DMD胚胎種植前診斷的實驗方法，為下一步開展胚胎種植前診斷和胚胎種植前遺傳學篩查、囊胚優(yōu)化提供實驗準備。
　　 方法：
　　 資料來源:
　　 1、病例主要來源于廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院、中山大學附屬第一醫(yī)院、廣州市兒童醫(yī)院和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，先證者均具有典型的DMD臨床表現(xiàn)，經(jīng)血清肌酶、肌電圖或肌組織活檢等檢查，排

12、除了其他神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病;
　　 2、攜帶者妊娠期抽取羊水組織或絨毛組織:
　　 3、知情同意廢棄的卵裂期單細胞及已知基因型DMD患者的單淋巴細胞。
　　 實驗方法:
　　 1、應用MLPA法對先證者進行檢測:采用SALSA probe mix P034和P035(MRC Holland)經(jīng)變性、雜交、連接反應、PCR反應和ABI3100遺傳分析儀毛細管電泳對產(chǎn)物進行分析，檢測DMD基因79個外顯子缺失

13、型以及重復型基因突變。
　　 2、篩選出155個有再生育要求，并且已明確攜帶了DMD基因雜合缺失或基因雜合重復的DMD攜帶者，對其風險胎兒進行產(chǎn)前診斷:其中，對148例攜帶者孕婦于妊娠16周以后行羊膜腔穿刺術以獲得羊水樣本;7例攜帶者孕婦于妊娠9-12周左右行絨毛膜穿刺術抽取絨毛組織。
　　 3、絨毛組織檢查時同時抽取攜帶者孕婦血液，對絨毛樣本和母體樣本進行DNA-STR分型。
　　 4、用RFPLI-g Mid

14、i對單細胞全基因組擴增(WGA)——多重置換擴增(MDA)，并用PCR及DMD-STR位點擴增進行驗證。
　　 結果：
　　 1、DMD先證者及其母親的基因診斷結果:對1119例臨床疑似DMD患者進行了基因診斷，檢測出缺失型和重復型DMD患者共725例，其中DMD基因缺失突變607例，占54％(607/1119)，DMD基因重復突變118例，占11％(118/1119)，未發(fā)現(xiàn)缺失和重復的394例，占35％(394/11

15、19)。
　　 2、DMD先證者缺失突變和重復突變的突變來源比較:在607例基因缺失突變患者中，342例母親為缺失突變攜帶者，265例為新發(fā)突變，突變率為43.66％(265/607);在118例基因重復突變的患者中，96例母親為重復突變攜帶者，22例為新發(fā)突變，突變率為18.64％(22/118)。經(jīng)卡方檢驗，Pearson Chi-Square=25.846P＜0.001，兩種突變類型的來源有顯著性差異。
　　 3、

16、MLPA法與熒光多重PCR方法的比較:對55例MLPA方法檢測DMD基因缺失或重復的DNA樣本用熒光多重PCR(fmPCR)方法進行檢測，可見55例中有4例用fmPCR檢不出的，而用MLPA方法能獲得79個外顯子全部信息，對基因的缺失與重復的檢測沒有出現(xiàn)漏診。
　　 4、缺失型和重復型DMD攜帶者產(chǎn)前診斷
　　 (1)產(chǎn)前診斷的結果:我們總共對155例診斷為缺失型或重復型攜帶者孕婦進行了產(chǎn)前診斷，其中148例抽取中期妊娠

17、羊水、7例抽取早期妊娠絨毛組織。檢出DMD患胎27例，占17％(27/155);胎兒DMD攜帶者28例，占18％(28/155);正常胎兒100例，占65％(100/155)。對DMD患胎給予終止妊娠，正常胎兒及DMD攜帶者胎兒給予繼續(xù)妊娠的處理。
　　 (2)胎兒的性別情況:155例產(chǎn)前診斷胎兒中，男胎72例，女胎83例。在72例男胎中，27例為患胎，占全部男胎的38％(27/72)，45例為正常男胎，占63％(45/72);

18、在83例女胎中，28例胎兒為攜帶者，占女胎的34％(28/83);55例為正常女胎，占66％(55/83)。
　　 (3) DMD基因突變的類型:在檢出的27例患胎中，DMD外顯子缺失突變22例(14.19％，22/155);外顯子重復突變5例(3.23％，5/155);在檢出的28例胎兒DMD基因攜帶者中，雜合缺失突變25例(16.13％，25/155)，雜合重復突變3例(1.94％，3/155);正常胎兒100例，占64.5

19、2％。
　　 (4) DMD外顯子累計被缺失與重復突變涉及的次數(shù):本研究中DMD基因缺失和重復突變主要分布在外顯子45～52之間，為突變熱點區(qū)域，其中外顯子49突變發(fā)生次數(shù)最高，共22次;在本研究中外顯子1和2未發(fā)現(xiàn)突變，外顯子56～79之間的突變發(fā)生次數(shù)較低，絕大部分只涉及1次;外顯子73涉及過2次。
　　 5、早期妊娠絨毛組織DMD產(chǎn)前基因診斷:對7例攜帶者進行了孕早期的DMD產(chǎn)前診斷:抽取早孕絨毛組織，用MLPA方

20、法進行全外顯子的檢測，并對樣本及母體進行DNA-STR分型以排除母源性污染?；蛟\斷結果:1例為DMDexon48-50基因缺失突變、胎兒DMD基因診斷明確為患兒，孕婦選擇終止妊娠;1例為DMD exon16-42雜合重復突變，胎兒DMD基因診斷明確為DMD攜帶者，給予繼續(xù)妊娠的處理;其余5例胎兒均正常。
　　 6、對8個單胚胎細胞進行了全基因組多重置換擴增(WGA-MDA)，并用PCR方法對DYS(Ⅱ)、DMD外顯子50、外顯

21、子49、外顯子12和外顯子17對MDA的擴增效果進行驗證;并用DMD44、49、50 STR、DYS(Ⅱ) STR及3'CA STR進行驗證，均可得到預期結果。
　　 結論：
　　 1、MLPA方法是目前為止檢測DMD缺失型和重復型基因突變的最有效的方法，能鑒別突變是缺失型還是重復型，也能區(qū)分患者與攜帶者，可用于該類型患者的診斷及攜帶者的產(chǎn)前診斷。
　　 2、采用MLPA方法結合DNA-STR分型技術對絨毛組織進

22、行檢測可用于DMD的孕早期診斷，有利于早期進行出生缺陷干預。
　　 3、本研究DMD基因突變主要分布在外顯子45～52之間，其中外顯子49突變發(fā)生次數(shù)最高，為突變熱點區(qū)域。
　　 4、DMD外顯子缺失突變和重復突變的突變率有顯著性差異，后者多遺傳自母親，新發(fā)突變較少。
　　 5、已建立了單卵裂球全基因組擴增-多重置換擴增實驗方法，并通過了DMD外顯子的PCR和STR對其擴增效果的驗證，為下一步開展胚胎種植前診斷和

23、胚胎種植前遺傳學篩查、囊胚優(yōu)化提供實驗準備。
　　 第二章、點突變型DMD基因診斷與篩查技術的建立及應用研究研究
　　 目的：通過上一章所建立的診斷技術流程，已經(jīng)可以解決基因的缺失突變和基因重復突變這兩類的患者診斷、攜帶者診斷及其產(chǎn)前診斷問題，也就是解決了約70％的DMD診斷問題。而剩下的約30％患者是由DMD基因的點突變引起，MLPA無法檢測點突變。由于DMD基因的龐大，目前我國還沒有醫(yī)療機構能常規(guī)地對DMD基因點突變

24、的患者進行檢測，因而也沒辦法對點突變的家系進行產(chǎn)前診斷。
　　 針對DMD如此龐大的基因，本研究擬建立更高效的全外顯子測序方法檢測其點突變，在一塊96孔板上加樣，經(jīng)一次的測序流程即可達到對全部79個外顯子的測序。通過本研究，可為目前臨床得不到常規(guī)基因診斷的點突變患者及攜帶者提供確診方法、進行產(chǎn)前診斷，最終可達到把DMD的基因診斷率從現(xiàn)時的70％至少提高到90％以上，將大大減少DMD患兒的出生。
　　 本研究還摸索用高分辨

25、溶解曲線(HRM)方法對DMD點突變進行篩查，試圖尋找一種可以用于點突變初篩的方法，以圖降低實驗成本。
　　 在本研究的另一部分，我們對DMD單個外顯子缺失情況進行了深入的研究，用基因測序結合PCR方法對MLPA判讀為單個外顯子缺失的DMD患者進行驗證，鑒別單外顯子是真正缺失還是點突變，避免由此引出的誤診，從而達到準確診斷的目的，并為基因修復治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 資料來源:病例主要來源本院，先證

26、者具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)血清肌酶、肌電圖或肌活檢證實，并排除其它類型的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病，經(jīng)MLPA證實不存在DMD基因外顯子的缺失和重復。
　　 實驗方法:
　　 1、采用Qiagen方法提取DMD患者外周血樣本基因組DNA;
　　 2、用MLPA方法排除先證者存在DMD基因外顯子的缺失和重復;
　　 3、用改良的96孔板全外顯子測序方法對DMD基因全部79個外顯子進行測序:經(jīng)PCR、PCR產(chǎn)物純化、測

27、序反應、測序PCR產(chǎn)物純化、ABI3100遺傳分析儀進行毛細管電泳、用GeneMapper ID v3.1軟件和Mutation Surveyor軟件進行結果分析等步驟獲得測序結果。
　　 4、采用LightScanner HRM32分析儀進行HRM檢測，對某些未知點突變和已知點突變樣本進行檢測。
　　 5、對MLPA法判斷為單個外顯子缺失的患者進行PCR及測序驗證。
　　 結果：
　　 1、用改良的96

28、孔板全外顯子測序方法對DMD基因全部79個外顯子進行分析:選擇臨床診斷為DMD患者，并且排除其他神經(jīng)肌肉疾病、且經(jīng)MLPA排除DMD缺失突變與重復突變的16例樣本進行了測序，本研究發(fā)現(xiàn)的點突變有:單堿基置換13例、單堿基缺失2例、2個堿基缺失1例，5個堿基插入1例，該例堿基的插入和三例堿基缺失導致了DMD的移碼突變。
　　 2、應用測序結合PCR方法對MLPA診斷為單個外顯子缺失的DMD患者進行驗證，以鑒別真缺失還是點突變:37

29、例MLPA法判斷為單外顯子缺失的樣本中30例確實為DMD基因外顯子的缺失，占單個外顯子缺失中的81.08％;而另外7例經(jīng)PCR法驗證未發(fā)現(xiàn)缺失，經(jīng)測序確證為存在外顯子的點突變，占單個外顯子缺失中的18.92％。
　　 3、HRM篩查DMD點突變方法的摸索
　　 (1)引物最佳退火溫度的優(yōu)化:設置Tm58℃/59℃/60℃/61℃/62℃/63℃/64℃/65℃，選擇61℃為最佳退火溫度。
　　 (2)DMD患者H

30、RM結果:對10例DMD點突變的樣本進行了HRM分析，其中7例可以出現(xiàn)突變曲線，其余3例未能出現(xiàn)預期的結果。
　　 4、對一例攜帶有DMD外顯子54: c.7874A＞G（家系156C）的點突變攜帶者孕婦進行了羊水產(chǎn)前診斷，胎兒為男性，結果為正常。
　　 結論：
　　 1、改良的96孔板全外顯子測序方法可通過一塊96孔板在一次實驗中完成對79個外顯子的全測序，是對點突變型DMD基因突變的高效可靠的檢測方法。測序技

31、術可用于DMD點突變攜帶者產(chǎn)前診斷。
　　 2、高分辨溶解曲線(HRM)能快速地對一些稀有突變基因型進行初篩檢測，但本研究不能分辨出300bp長度以上的擴增子中一個堿基的變化，對于擴增子為300bp以上的外顯子需重新進行引物設計、PCR條件優(yōu)化。
　　 3、經(jīng)MLPA檢測DMD基因為單個外顯子缺失時，應聯(lián)合應用PCR和基因測序技術進行鑒別，以區(qū)分真缺失還是點突變，提高診斷的準確率。
　　 第三章、女性DMD發(fā)病機

32、制研究及羊水iPS細胞系建立研究
　　 目的：DMD/BMD為X染色體隱性遺傳病，理論上發(fā)病者為男性，所以女性發(fā)病者多被誤診為與其癥狀相似的常染色體隱性遺傳的肢帶型肌營養(yǎng)不良，近年來研究顯示女性患者的發(fā)病機制可能涉及X染色體失活等表觀遺傳調控，因此，研究女性發(fā)病者的分子機理具有較為重要的臨床價值和科學意義。本研究利用測序、染色體核型分析等方法、并采用Affymetrix CytoScan HD高分辨率基因芯片對女性DMD患者進行

33、全基因組檢測，分析其是否微小缺失/重復，采用甲基化特異的PCR檢測X染色體失活狀態(tài)，研究其與女性DMD發(fā)病的相關性。
　　 DMD至今無特異性治療，只能對癥治療和支持治療。尋找有效的方法治療DMD一直是神經(jīng)病學界研究的熱點話題。誘導性多能干細胞(iPS)以其較好的免疫相容性被認為是可以作為治療各種疾病的潛在來源，也是疾病機理研究的理想模型。羊水中細胞成分眾多，目前認為羊水細胞是來源于胎兒和羊膜的異質細胞群體，由不同來源的多種細胞

34、組成。羊水細胞具有良好多能性，可被誘導分化為各個胚層的細胞類型，本研究擬利用OCT4、KLF4兩因子法誘導羊水細胞重編程，獲得iPSCs，為DMD的干細胞治療和疾病模型建立提供良好的研究基礎。
　　 方法：
　　 資料來源:
　　 1、選擇在廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院就診的4名女性DMD患者;
　　 2、羊水細胞:收集我院產(chǎn)前診斷中心具有羊水穿刺指證的1名孕婦20孕周，產(chǎn)前診斷檢測后廢棄的羊水細胞，經(jīng)捐贈夫婦

35、知情同意及倫理委員會同意用于本實驗。
　　 實驗方法:
　　 1、用Qiagen方法提取女性DMD患者外周血樣本基因組DNA，按照Affymtrix公司CytoScan HD芯片操作規(guī)程進行操作及質檢;
　　 2、X染色體失活狀態(tài)檢測:基因組DNA經(jīng)過硫酸鹽處理后采用甲基化特異的引物進行擴增，產(chǎn)物進行毛細管電泳分析。
　　 3、iPS細胞制備:經(jīng)羊水細胞收集傳代、羊水細胞感染、hAFDC-iPSCs原代培

36、養(yǎng)、hAFDC-iPSCs傳代、RT-PCR檢測多能性基因、堿性磷酸酶(AP)檢測、免疫熒光染色、體外分化能力檢測、體內分化潛能的檢測及染色體核型分析等主要步驟，制備iPS細胞。
　　 結果：
　　 1、DMD基因雙突變是女性患者發(fā)病機理之一:對一例女性DMD患者測序發(fā)現(xiàn)存在著DMD外顯子10: c.1034A＞G和DMD外顯子21: c.2645G＞A兩處單堿基置換突變。估計這兩處突變發(fā)生在不同的X染色體上，為雜合重復

37、突變，導致女性發(fā)病。
　　 2、染色體核型異常導致女性DMD發(fā)生:對一例女性DMD患者進行了染色體核型分析，其核型是:46X，iX(q10)，即她的兩條X染色體中的一條為X長臂等臂染色體，這一條染色體的短臂是丟失的，位于短臂上的DMD基因也因此丟失，而另一條正常的X染色體上DMD外顯子46-47發(fā)生了缺失突變，導致了這例女孩的發(fā)病。
　　 3、高分辨率基因芯片分析女性患者DMD基因拷貝數(shù)分析:
　　 對一個女性D

38、MD患者及其父母進行全基因組拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)患者DMD基因2-37外顯子重復（即拷貝數(shù)增加），該結果與MLPA檢測結果一致。患者母親DMD基因第4內含子也存在一個重復片段，長度為10Kbp。經(jīng)SNP基因分型發(fā)現(xiàn)患者重復的等位基因來源于母親。
　　 對MLPA檢測未發(fā)現(xiàn)異常的一例女性DMD患者進行全基因組拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)Xp21.1區(qū)存在31 Kbp的拷貝數(shù)增加，該片段覆蓋DMD基因第47外顯子部分區(qū)域。第9內含子存在2kbp的拷

39、貝數(shù)增加。
　　 4、女性DMD患者X染色體傾斜失活狀態(tài)檢測:對上述兩個女性DMD家系的先證者和母親進行X染色體傾斜失活分析發(fā)現(xiàn)，一例先證者為隨機失活，母親為傾斜失活;另一例先證者為傾斜失活，母親為隨機失活。
　　 5、用包裝hOct4、hKlf4等因子的逆轉錄病毒感染羊水細胞，感染后第6天，未分化hAFDC-iPSCs克隆AP檢測均呈強陽性圖。將克隆樣生長細胞挑到無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基培養(yǎng)，可見細胞緊密排列，邊界明顯未分化。h

40、AFDC-iPSCs每傳10代進行核型檢測，已傳至40代，在傳代過程中2株細胞均能維持正常核型46，XX。hAFDC-iPSCs與人胚胎干細胞系(FY-HES-1)表達含量基本相一致，Oct4、NANOG基因呈高表達，羊水細胞不表達。hAFDC-iPSCs克隆表面抗原TRA-1-60呈現(xiàn)強陽性;NANOG/OCT4表達陽性，顯示未分化狀態(tài)。
　　 結論：
　　 1、DMD基因雙突變是導致女性DMD患者發(fā)病的原因之一;

41、r>　　 2、DMD基因突變合并染色體核型異常如X等臂染色體等可導致女性DMD發(fā)生;
　　 3、利用高密度基因芯片應用于女性DMD患者發(fā)病機理的研究發(fā)現(xiàn)DMD基因存在拷貝數(shù)變異，部分變異可能涉及外顯子。一個女性含有外顯子2-37重復突變，患者的母親DMD基因內含子存在小片段重復，而患者發(fā)生2-37重復的等位基因來源于母親。
　　 4、利用OCT4、KLF4兩因子法誘導羊水細胞重編程，獲得iPSCs，為DMD的干細胞治療