電刺激對(duì)維生素C誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討電刺激在體外對(duì)維生素C誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的作用。
　　方法：1.復(fù)蘇小鼠來(lái)源的iPSCs，接種于絲裂霉素C預(yù)處理的MEF飼養(yǎng)層上，通過光學(xué)顯微鏡觀察iPSCs生長(zhǎng)的形態(tài)變化特征，熒光顯微鏡觀察干細(xì)胞全能性基因Oct-4的表達(dá)以及堿性磷酸酶(AP)染色三個(gè)方面鑒定未分化的iPSCs。
　　2.采用懸滴法使iPSCs形成EBs，維生素C誘導(dǎo)其分化，按是否給予電刺激將其分為電刺激組與非電刺激組。觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)

2、情況，記錄各組擬胚體出現(xiàn)跳動(dòng)的時(shí)間和跳動(dòng)擬胚體的數(shù)量，計(jì)算心肌細(xì)胞分化率。共聚焦顯微鏡成像結(jié)合免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)心肌特異性肌鈣蛋白(c-TnT)的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)Oct-4、心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和心肌特異性肌球蛋白重鏈α-MHC的基因表達(dá)。
　　結(jié)果：1.接種于MEF飼養(yǎng)層的iPSCs呈散在分布的克隆團(tuán)貼壁生長(zhǎng)，iPSCs集落中央的細(xì)胞排列緊密，邊緣折光性強(qiáng)，與飼養(yǎng)層細(xì)胞界限清楚;在熒光顯微鏡下，GFP轉(zhuǎn)Oc

3、t-4基因的iPSCs細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光集落（Oct-4陽(yáng)性）;AP染色顯示，iPSCs克隆團(tuán)著深紫色。
　　2.兩組在誘導(dǎo)分化過程中均出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)的擬胚體，電刺激組擬胚體較非電刺激組分化更快，更早出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)（3天vs5天），心肌細(xì)胞分化率更高[(68.89±5.09)％vs（52.22±3.85）％]，差異有顯著性，P＜0.05。
　　3.兩組搏動(dòng)區(qū)域細(xì)胞均表達(dá)心肌特異性肌鈣蛋白c-TnT，電刺激組細(xì)胞c-TnT表達(dá)更清楚

4、。
　　4.在誘導(dǎo)分化過程中，Oct-4 mRNA表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，電刺激組較非電刺激組降低更快(P＜0.05)。兩組均檢測(cè)到心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記分子GATA-4和α-MHC的表達(dá)。在誘導(dǎo)分化相同時(shí)間點(diǎn)，電刺激組GATA-4和α-MHC表達(dá)水平均高于非電刺激組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：在LIF和絲裂霉素C預(yù)處理的MEF飼養(yǎng)層環(huán)境中，iPSCs保持未分化狀態(tài)不斷增殖;模擬心臟電學(xué)微環(huán)境的電刺激在一定程度上有助于維生