人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞及其用于中藥肝毒性評(píng)價(jià)的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.建立人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞模型。
　　2.初步評(píng)價(jià)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞在中藥肝毒性檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　方法:
　　1.人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的細(xì)胞因子4階段誘導(dǎo)分化方法:第1階段，內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)，即在人iPSCs中加入100 ng/mL激活素A(Activin A)、10 ng/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)、20 ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)、2％ B27和1640

2、細(xì)胞培養(yǎng)液，每天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，一共8天;第2階段，內(nèi)胚層細(xì)胞向類肝細(xì)胞的分化，即加入20 ng/mL BMP-4、10 ng/mL FGF-2、2％ B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液，每天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，一共5天;第3階段，類肝細(xì)胞的擴(kuò)增，即加入20 ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、2％ B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液，每天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，一共5天;第4階段，類肝細(xì)胞的成熟，加入HCM和20 ng/mL制瘤素M(Oncostat in M)，每天

3、換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，一共5天。用倒置熒光顯微鏡拍攝人iPSCs的誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)動(dòng)態(tài)變化，觀察人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞的形態(tài)。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunofluorescence staining):用4％濃度的多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用0.5％ Triton在細(xì)胞表面穿孔，用山羊血清封閉1個(gè)小時(shí)，加入1％BSA稀釋的一抗，37℃雜交2個(gè)小時(shí)，避光放置在4℃過(guò)夜，加入的1％BSA稀釋的二抗，放置在37℃，雜交1

4、個(gè)小時(shí)。加入5μg/mL的DAPI染核，拿到熒光顯微鏡下拍照并保存圖片。觀察人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞過(guò)程中的特異性蛋白:倒置熒光顯微鏡觀察誘導(dǎo)過(guò)程中的第8天后限定性內(nèi)胚層特異性蛋白叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2(FOXA2)和性別決定區(qū)Y框蛋白17(SOX17)的表達(dá)情況，看其是否表達(dá)來(lái)確定內(nèi)胚層細(xì)胞是否誘導(dǎo)成功;第18天后肝細(xì)胞特異性蛋白甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表達(dá)情況，看其是否表達(dá)來(lái)確定類肝細(xì)胞是否形成;第23天后成熟肝細(xì)胞功能蛋

5、白α1-抗胰蛋白酶（AAT）、肝細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4)的表達(dá)情況，看其是否表達(dá)來(lái)確定誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞是否具有人成熟肝細(xì)胞的主要功能特異性蛋白。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):提取總RNA，然后按照試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，使用7500 PCR儀檢測(cè)。檢測(cè)誘導(dǎo)第23天后肝細(xì)胞特異性基因細(xì)胞角蛋白8(CK8)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、AFP、ALB的表達(dá)，觀察誘導(dǎo)

6、后的類肝細(xì)胞的人肝細(xì)胞是否表達(dá)人成熟肝細(xì)胞的主要基因。
　　4.吲哚青綠(ICG)攝取實(shí)驗(yàn):第23天將ICG加入到類肝細(xì)胞中，37℃孵育1h，光學(xué)顯微鏡下觀察ICG是否被誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞攝取以確定誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞的特異性功能。
　　5.雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后，在成功誘導(dǎo)好的類肝細(xì)胞中加入雷公藤凍干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg

7、/mL，在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在570 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性，取細(xì)胞按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在532 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算丙二醛(MDA)的濃度，在410 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算谷胱甘肽(GSH)的濃度和在450 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算超氧化物歧化酶(SOD)的活性，初步評(píng)價(jià)雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的肝毒性作用

8、。
　　6.雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后，在LO2細(xì)胞中加入雷公藤凍干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL，在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在570 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算ALT、AST的活性，取細(xì)胞按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在532 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算MDA的濃度，在410 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算GSH的濃

9、度和在450 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算SOD的活性，初步評(píng)價(jià)雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝毒性作用。
　　7.雷公藤甲素對(duì)人iPSCs類肝細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后，在成功誘導(dǎo)好的類肝細(xì)胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL，在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在570 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算ALT、AST的活性，取細(xì)胞

10、按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在532 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算MDA的濃度，在410 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算GSH的濃度和在450 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算SOD的活性，初步評(píng)價(jià)雷公藤甲素對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的肝毒性作用。
　　8.雷公藤甲素對(duì)LO2細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后，在LO2細(xì)胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL，在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24

11、h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在570 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算ALT、AST的活性，取細(xì)胞按照試劑盒操作方法，用酶標(biāo)儀在532 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算MDA的濃度，在410 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算GSH的濃度和在450 nm檢測(cè)OD值并計(jì)算SOD的活性，初步評(píng)價(jià)雷公藤甲素對(duì)LO2細(xì)胞的肝毒性作用。
　　9.雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較對(duì)比雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞與雷公

12、藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝毒性作用，初步評(píng)價(jià)人iPSCs誘導(dǎo)的類肝細(xì)胞在中藥肝毒性檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　10.雷公藤甲素對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較對(duì)比雷公藤甲素對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞與雷公藤甲素對(duì)LO2細(xì)胞的肝毒性作用，初步評(píng)價(jià)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞在中藥肝毒性檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　結(jié)果:
　　1.人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)動(dòng)態(tài)變化:倒置熒光顯微鏡光學(xué)圖片顯示，誘導(dǎo)的第0

13、d的人iPSCs呈克隆團(tuán)塊樣生長(zhǎng)，每個(gè)克隆團(tuán)塊由多個(gè)單個(gè)細(xì)胞相互密集契合組成，單個(gè)細(xì)胞的大小、形狀不一致，邊緣棱角清晰;誘導(dǎo)的第3d，相對(duì)于第0d，克隆內(nèi)的細(xì)胞逐漸變大，形態(tài)逐漸變圓;誘導(dǎo)第12 d，可觀察到相對(duì)于第3d，克隆內(nèi)的細(xì)胞變大，形狀趨于一致，棱角逐漸不明顯;誘導(dǎo)第23 d，克隆內(nèi)的大部分細(xì)胞變成大小、形狀均一的多邊形細(xì)胞，細(xì)胞呈鋪路石樣整齊排列。說(shuō)明人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞具有人肝細(xì)胞的形態(tài)。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色

14、結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示限定性內(nèi)胚層特異性蛋白FoxA2和Sox17在內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)階段有表達(dá)，誘導(dǎo)率均為80％左右，說(shuō)明內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)成功;肝細(xì)胞特異性蛋白AFP和ALB在人iPSCs向類肝細(xì)胞分化階段和類肝細(xì)胞增殖階段有表達(dá)，誘導(dǎo)率均為90％左右，說(shuō)明類肝細(xì)胞已經(jīng)形成;肝細(xì)胞功能性蛋白AAT和CYP3A4在類肝細(xì)胞成熟階段有表達(dá)，誘導(dǎo)率分別為80％和90％左右，說(shuō)明人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞具有人成熟肝細(xì)胞的主要功能特異性蛋

15、白。
　　3.qPCR對(duì)人肝特異性基因的檢測(cè)結(jié)果:qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示肝細(xì)胞特異性基因CK8、CK18、CK19、AFP、ALB在類肝細(xì)胞中有表達(dá)，相對(duì)于誘導(dǎo)前的細(xì)胞，人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞基因表達(dá)率明顯升高。
　　4.ICG攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果:ICG攝取實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞被染成綠色，說(shuō)明人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞具有人肝細(xì)胞的特異性功能。
　　5.雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs源的肝細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的

16、對(duì)照組比較，雷公藤凍干粉的1，2，4，8 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MDA的濃度顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低，呈劑量負(fù)相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對(duì)照組比較，雷公藤凍干粉的1，2，4，8 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的AL

17、T和AST含量顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MDA的濃度顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低，呈劑量負(fù)相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.雷公藤甲素對(duì)人iPSCs源的肝細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對(duì)照組比較，雷公藤甲素的2，6，10，20 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MD

18、A的濃度顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低，呈劑量負(fù)相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8.雷公藤甲素對(duì)LO2細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對(duì)照組比較，雷公藤凍干粉的1，2，4，8 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MDA的濃度顯著升高，呈劑量正相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活

19、性顯著降低，呈劑量負(fù)相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　9.雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較:人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，LO2細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜毒性與雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜毒性的作用趨勢(shì)一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝

20、細(xì)胞中MDA濃度隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，LO2細(xì)胞上清中MDA濃度隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化毒性與雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜膜脂質(zhì)過(guò)氧化毒性的作用趨勢(shì)一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量負(fù)相關(guān)性，LO2細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而

21、升高，呈劑量負(fù)相關(guān)性，雷公藤凍干粉對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性與雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性的作用趨勢(shì)一致。
　　10.雷公藤甲素對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較:人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，LO2細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，雷公藤甲素對(duì)人iPSC

22、s誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜毒性與雷公藤甲素對(duì)LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜毒性的作用趨勢(shì)一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞中MDA濃度隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，LO2細(xì)胞上清中MDA濃度隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關(guān)性，雷公藤甲素對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化毒性與雷公藤甲素對(duì)LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜膜脂質(zhì)過(guò)氧化毒性的作用趨勢(shì)一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈

23、劑量負(fù)相關(guān)性，LO2細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量負(fù)相關(guān)性，雷公藤甲素對(duì)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性與雷公藤凍干粉對(duì)LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性的作用趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論:
　　1.人iPSCs細(xì)胞因子四步誘導(dǎo)分化方法可以將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成類肝細(xì)胞，分化成的類肝細(xì)胞具有肝細(xì)胞的形態(tài)，肝細(xì)胞的特異性蛋白，基因，肝細(xì)胞的特異性功能。
　　2.雷