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文檔簡介
1、【背景與目的】精子發(fā)生是從精原干細(xì)胞發(fā)育到高度分化的精子細(xì)胞的過程,這個(gè)過程被嚴(yán)格調(diào)控,其中轉(zhuǎn)錄因子(TFs)發(fā)揮著重要作用。組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Lineage-specific transcription factors),在特異的組織細(xì)胞發(fā)育過程中通過控制細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá),從而影響細(xì)胞分化。精原干細(xì)胞(SSCs)是機(jī)體內(nèi)唯一能遺傳信息及表觀遺傳信息至下一代的干細(xì)胞。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在精原干細(xì)胞發(fā)育和功能維持中,Bcl6b、
2、Etv5、Lhx1、ID4、Plzf、Taf4b及Foxo1、Nanos2、Blimp1、Prdm14、Tfap2c及多種MicroRNA發(fā)揮著重要作用。
前期工作通過慢病毒載體將六個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4、c-myc、Nanog及LIN28導(dǎo)入人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HuMSCs)中,并成功重編程為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPS),HuMSCs源iPS表達(dá)多能性相關(guān)基因(SOX2、OCT4、TDGF1、THY-1、REX
3、1和TERF1)及胚胎干細(xì)胞特異性蛋白(OCT4、TRA-l-8、NANOG及SSEA-4),在體內(nèi)外都能向3個(gè)胚層方向分化,經(jīng)BMP4誘導(dǎo)后能表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4及早期減數(shù)分?jǐn)?shù)標(biāo)記 SYCP3,使晚期減數(shù)分裂標(biāo)記PRM1表達(dá)量增加。Bcl6b等組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子在精原干細(xì)胞發(fā)育及功能維持中發(fā)揮重要作用,但其在向生殖細(xì)胞分化過程中表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制仍少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將研究組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Bcl6b、Etv5、Lhx1、
4、ID4、Plzf、Taf4b及Foxo1,在HuMSCs源 IPS細(xì)胞經(jīng) BMP4向男性生殖方向誘導(dǎo)分化過程中發(fā)揮的表達(dá)變化及其表達(dá)規(guī)律,進(jìn)一步為部分不明原因的生精障礙患者的發(fā)病機(jī)制提供新理論基礎(chǔ)。
【材料與方法】 HuMSCs源 iPS在體外經(jīng) EB(embryoid body)形成的方法,加入誘導(dǎo)劑(BMP4)向男性生殖細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化。EB形成后第一天(D0),向?qū)嶒?yàn)組EB培養(yǎng)基中加入BMP4(100ng/ml),對(duì)照組
5、(自發(fā)分化組)繼續(xù)用EB培養(yǎng)基培養(yǎng),使其自發(fā)分化。分別于不同時(shí)間點(diǎn)(D0、D3、D7、D10、D14及D21)觀察EB形態(tài)變化及收集細(xì)胞提取RNA通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子(Bcl6b、Etv5、Lhx1、ID4、Plzf、Taf4b及Foxo1)表達(dá)量變化(以誘導(dǎo)前即D0的表達(dá)量為基礎(chǔ)表達(dá)量,不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均與基礎(chǔ)表達(dá)量相比)。
【結(jié)果】HuMSCs源iPS細(xì)胞經(jīng)BMP4(100ng/ml)向男性生殖細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化過
6、程的不同時(shí)期,Bcl6b等七個(gè)組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子較自發(fā)分化組表達(dá)量升高,且表達(dá)呈程序化。Lhx1在誘導(dǎo)第3天表達(dá)量明顯上調(diào),第7天表達(dá)量稍低但仍高于自發(fā)分化組,第10天又再次出現(xiàn)表達(dá)量明顯上調(diào),且持續(xù)至第21天,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在誘導(dǎo)第14天表達(dá)量最高,達(dá)基礎(chǔ)表達(dá)量15倍以上。ID4在誘導(dǎo)第3天表達(dá)量較自發(fā)分化組開始上調(diào),且持續(xù)至第21天,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在誘導(dǎo)第14天表達(dá)量最高,達(dá)基礎(chǔ)表達(dá)量3倍以上。Bcl6b在誘導(dǎo)第7天
7、表達(dá)量開始上調(diào),持續(xù)至第14天,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在誘導(dǎo)第14天表達(dá)量最高,達(dá)基礎(chǔ)表達(dá)量2倍以上。Etv5在誘導(dǎo)第7天表達(dá)量開始明顯升高,且持續(xù)至第21天,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在誘導(dǎo)第14天表達(dá)量最高,達(dá)基礎(chǔ)表達(dá)量4倍以上。Taf4b、Foxo1及Plzf均在誘導(dǎo)第10天表達(dá)量明顯升高,持續(xù)至第14天,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05;Foxo1及Plzf均在誘導(dǎo)第14天表達(dá)量最高,分別達(dá)到基礎(chǔ)表達(dá)量的1.5倍及10倍以上,Taf4b
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