運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中實(shí)時(shí)定量PCR體系的建立及主碳代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄初步分析.pdf

1、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ZM4（ZM4）因其高的醇產(chǎn)率和耐受力受到越來(lái)越多的關(guān)注，成為生物乙醇生產(chǎn)的候選菌株。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ZM4基因組測(cè)序及全基因組模型發(fā)表，對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的代謝網(wǎng)絡(luò)、產(chǎn)醇策略等有了很大指導(dǎo)意義，特別是與主碳轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、產(chǎn)醇相關(guān)的基因受到了較多的關(guān)注。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組，獲得與基因轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)的信息，可以揭示基因表達(dá)與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系，加深對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的認(rèn)識(shí)，有利于進(jìn)一步利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
　　結(jié)合RNA的反

2、轉(zhuǎn)錄體系，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)已成為對(duì)各種組織細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的重要技術(shù)手段。而熒光定量標(biāo)準(zhǔn)化概念——MIQE的提出，將引導(dǎo)今后定量實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的完整性、重現(xiàn)性和可靠性，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室之間的一致性。
　　目前Real-timeqPCR技術(shù)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的研究很少。本文主要目的是在ZM4中建立Real-timeqPCR技術(shù)平臺(tái)，并確定一套可靠的用于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)錄分析數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的體系，包括內(nèi)參基因的選擇，對(duì)目的基因轉(zhuǎn)錄

3、水平的檢測(cè)及分析，確定在不同生長(zhǎng)階段ZM4主碳代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的變化等，進(jìn)而將該體系應(yīng)用于不同碳源及糖濃度下主碳代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平變化分析。
　　本文建立了ZM4總RNA提取及定量的方法體系和在ZM4中利用real-timeqPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析的詳細(xì)方法。在內(nèi)參基因的篩選中，利用real-timeqPCR技術(shù)研究了18個(gè)候選內(nèi)參基因在ZM4整個(gè)生長(zhǎng)周期中的mRNA水平。利用geNorm、NormFinder和BestKeep

4、er三個(gè)軟件綜合評(píng)價(jià)，篩選出7個(gè)相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的候選內(nèi)參基因，最終確定了ZMO0367，ZMO0487和ZMO1955作為內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，分析ZM4不同生長(zhǎng)階段主碳代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平變化。以此確立了Real-timeqPCR技術(shù)平臺(tái)用于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)錄分析數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的體系。
　　在此基礎(chǔ)上，本文分析了在RM培養(yǎng)基中分別添加2％葡萄糖，15%葡萄糖，20%葡萄糖，28.5%蔗糖和38%蔗糖5個(gè)培養(yǎng)條件下野生型ZM4及突變株

5、ZM4(gfo::FRT)（插入缺失gfo基因）在對(duì)數(shù)中期、穩(wěn)定期的26個(gè)樣本中主碳代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的差異性，并利用HLPC法分析了5個(gè)培養(yǎng)條件下兩菌株代謝物水平的變化。篩選的7個(gè)內(nèi)參基因在一定研究條件下有較好的穩(wěn)定性。gfo基因的缺失對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇代謝基因轉(zhuǎn)錄水平有一定的影響，尤其在蔗糖發(fā)酵中較為明顯。ZM4(gfo::FRT)菌株在蔗糖中醇產(chǎn)率較ZM4高，主要是由gfo基因的缺失使得其它基因轉(zhuǎn)錄水平及代謝流變化引起的。