檢測HBVcccDNA的巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，嚴(yán)重危害人們的生命健康。 我國是HBV 感染的高發(fā)區(qū)，由于缺乏有效的治療方法，每年約30 萬人死于HBV 慢性感染所引發(fā)的重型肝炎、肝硬化和肝癌等相關(guān)疾病。防治HBV 感染是我國極為重要的公共衛(wèi)生問題之一。 臨床和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些乙肝患者血液中HBV-DNA 雖已轉(zhuǎn)陰，但病情并未緩解，病毒復(fù)制仍未停止，停用抗病毒藥物后，病情仍可復(fù)發(fā)。原因就在于HBV 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA

2、）的存在。cccDNA 是HBV 基因組（雙鏈松弛環(huán)狀DNA，rcDNA）進(jìn)入肝細(xì)胞核后轉(zhuǎn)變而成。它是HBV 前基因組RNA 復(fù)制的原始模板，是病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素，也是HBV 復(fù)制最特異的指標(biāo)。只有清除體內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)。 抗HBV 藥物能有效清除外周血中的HBV，但對細(xì)胞核內(nèi)cccDNA 影響甚微。 檢測HBVcccDNA 有助于更進(jìn)一步了解HBV 的復(fù)制狀態(tài)和抗病毒治療效果。

3、 國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量探索，建立多種檢測HBVcccDNA 的方法，但因特異性和敏感性等問題，未用于臨床。 基于上述原因，本課題研究將巢式PCR 與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相結(jié)合，建立一種特異、靈敏的巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，用于慢性乙肝患者PBMC 和血清標(biāo)本中HBVcccDNA 的檢測，為研究HBV 復(fù)制、評價(jià)抗病毒藥物療效、指導(dǎo)臨床制定合理的個(gè)體化治療方案以及評價(jià)移植肝臟是否被再感染等提供重要手段。 本項(xiàng)課題

4、主要研究內(nèi)容包括以下四個(gè)方面： 1、HBVcccDNA 定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用pBR322 ADR質(zhì)粒（命名P1.2Ⅱ）作為定量檢測HBVcccDNA的標(biāo)準(zhǔn)品。 該質(zhì)粒包含adr型HBV全基因組，其HBV的直接重復(fù)序列（DR）附近不存在缺口，為完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，與HBVcccDNA結(jié)構(gòu)、性質(zhì)類似。首先進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，取3 次A值的平均值，再由公式： 質(zhì)粒拷貝數(shù)＝（M/W）×6.02

5、×1023計(jì)算出拷貝數(shù)，根據(jù)需要做適當(dāng)稀釋，作為陽性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品。 2、HBVcccDNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法的建立 根據(jù)HBV基因組DNA與cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異及理化性質(zhì)的不同，設(shè)計(jì)一對跨雙鏈缺口的特異性引物及一條位于負(fù)鏈缺口下游的特異性TaqMan探針，用熒光定量PCR儀，擴(kuò)增跨雙鏈缺口的特異性HBV-DNA片段（約365bp）。 模板DNA制備先用質(zhì)粒提取試劑去除部分rcDNA，再用Plas

6、mid-SafeTMATP-Dependent Dnase（PSAD）進(jìn)行酶切純化，進(jìn)一步降解rcDNA。 3、HBVcccDNA 巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的建立 熒光定量PCR 的敏感性受擴(kuò)增片段大小的影響，最適片段大小為50-150bp，片段過大，敏感性下降。因此，將巢式PCR 與熒光定量PCR 相結(jié)合，建立巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR。設(shè)計(jì)一對跨雙鏈缺口的外引物和一對跨負(fù)鏈缺口的內(nèi)引物及一條位于負(fù)鏈缺口下游的Ta

7、qMan 探針。用上述方法處理、純化模板。用外引物對模板進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，所得到的跨雙鏈缺口425bp 產(chǎn)物再用內(nèi)引物和熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增。根據(jù)陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品，測出待檢標(biāo)本中cccDNA 的起始拷貝數(shù)。 4、慢性乙肝患者PBMC 及血清HBVcccDNA 的定量檢測 采用建立的巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，檢測了34 例CHB 患者的PBMC 和血清標(biāo)本、14 例非活動性HBsAg 攜帶者和12 例體

8、檢者的血清標(biāo)本中HBVcccDNA。首先用質(zhì)粒提取試劑盒提取患者PBMC 中的DNA，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit 提取血清中的DNA，再用不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA 酶(Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase, PSAD)酶切純化模板，最后進(jìn)行巢式-實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增，并對患者ALT、血清HBV-DNA、HBVcccDNA及PBMC 中HBV-DNA、cccDNA 進(jìn)行相

9、關(guān)性分析，評價(jià)其臨床意義。 結(jié)果： 1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測HBVcccDNA的下限為1×105copies/mL。敏感性較低，難以滿足臨床檢測需要。 2、巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測HBVcccDNA的下限為1×102copies/mL。 敏感性較單純實(shí)時(shí)熒光定量PCR提高了1000 倍。擴(kuò)增陽性產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定，無堿基缺失、突變，且與Genbank中HBV基因序列同源性達(dá)98％～100％，表明

10、具有良好的特異性。 3、34 例CHB 患者血清和PBMC 中HBV-DNA 均為陽性。PBMC 中檢出28例（82.35％）cccDNA，定量對數(shù)值范圍在2.38～5.31；血清標(biāo)本中25 例（73.53％）檢出cccDNA，定量值范圍在2.34～5.62。（文中均以定量對數(shù)值表示定量拷貝值，描述為定量值） 4、14 例非活動性HBsAg 攜帶者血清標(biāo)本中有6 例（42.86％）檢出cccDNA，定量值范圍在2.80～

11、3.48。12 例體檢者中2 例抗HBs 陽性者血清中檢出cccDNA，定量值分別為3.14 和3.68。 5、對34 例患者ALT、血清中HBV-DNA、cccDNA 及PBMC 中HBV-DNA、cccDNA 及HBV 免疫標(biāo)志物定量檢測值進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清cccDNA 與血清HBV-DNA 及PBMC 中HBV-DNA 呈顯著正相關(guān)；HBsAg 與血清cccDNA 呈顯著相關(guān)，其它各因素間未見明顯相關(guān)性。

12、結(jié)論: 1、本文建立的巢式-實(shí)時(shí)定量PCR 檢測方法具有較高的特異性和敏感性，能定量檢測血清、PBMC 標(biāo)本中的HBVcccDNA。 2、CHB 患者PBMC 和血清標(biāo)本中HBVcccDNA 含量均較低。PBMC 中檢出cccDNA，提示PBMC 可能成為CHB 患者肝外cccDNA 的“儲存池”,可作為臨床評估抗HBV 療效、確定抗病毒治療的終點(diǎn)，預(yù)測病情復(fù)發(fā)的指標(biāo)。 3、CHB 患者外周血血清中檢測出HBVc