基于切刻內(nèi)切酶的核酸信號(hào)放大技術(shù)用于蛋白及DNA修飾酶的熒光檢測(cè).pdf

1、對(duì)特定核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，是分子生物學(xué)中的一項(xiàng)基本技術(shù)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以及生物化學(xué)、生物物理學(xué)等交叉學(xué)科在分子生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，涌現(xiàn)了許多新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)、鏈置換放大技術(shù)(SDA)等。
　　基于核酸切刻內(nèi)切酶的核酸放大方法最為一種新型的鏈置換放大技術(shù)已經(jīng)被越來越多的研究者所關(guān)注。該方法主要建立在核酸切刻內(nèi)切酶以DNA雙鏈為識(shí)別序列，但只切割其中的一條單鏈的特殊功能上。該

2、放大方法的原理是，在核酸切刻內(nèi)切酶切刻形成的裂口處，通過聚合酶的作用以dNTPs為原料從裂口處的3’端聚合延伸，置換出等位的DNA鏈，由此又形成了新的完整的含有切刻酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列。這條雙鏈再次被核酸切刻內(nèi)切酶識(shí)別切割，進(jìn)而開始“聚合-切刻”的循環(huán)，產(chǎn)生大量被置換下來的DNA單鏈。最后通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)換方式進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。該方法通過聚合-切刻循環(huán)，可以顯著增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。
　　基于上述方法，綜合文獻(xiàn)報(bào)道，本論文主要利用核酸切刻內(nèi)切

3、酶信號(hào)放大技術(shù)用于免疫分析以及對(duì)一些重要DNA修飾酶進(jìn)行熒光檢測(cè)，主要內(nèi)容如下：
　　(1)發(fā)展了一種基于核酸切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大技術(shù)的免疫分析方法。該方法以人IgG為檢測(cè)模型，首先利用酶聯(lián)免疫技術(shù)的傳統(tǒng)方法依次將羊抗人IgG抗體、人IgG和生物素標(biāo)記的抗體固定在聚苯乙烯微孔板上，形成免疫夾心結(jié)構(gòu)。然后通過生物素與親和素的特異性結(jié)合反應(yīng)，利用鏈霉親和素將生物素標(biāo)記的抗體和生物素修飾的引物探針鏈接起來，之后通過引物探針與模板雜交，

4、并在聚合酶和核酸切刻內(nèi)切酶的共同作用下進(jìn)行切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大反應(yīng)。最后將核酸放大后的寡核苷酸單鏈與分子信標(biāo)雜交，從而通過檢測(cè)熒光來測(cè)定目標(biāo)抗原的濃度。該方法將傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫技術(shù)與新型的切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大技術(shù)結(jié)合起來，具有高效，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)下限大0.1ng/mL。
　　(2)基于切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大技術(shù)，開發(fā)了一種對(duì)磷酸酶檢測(cè)的方法。該方法以T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)為研究模型，對(duì)其DNA3’端磷酸酶活性

5、進(jìn)行監(jiān)測(cè)。利用一條3’端帶有磷酸基團(tuán)且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，通過T4 PNK將其3’端磷酸基團(tuán)修復(fù)成羥基，觸發(fā)DNA聚合酶聚合延伸，從而啟動(dòng)切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大。經(jīng)過切刻循環(huán)放大產(chǎn)生的大量單鏈DNA與分子信標(biāo)雜交，打開分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過熒光信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)T4 PNK的磷酸酶活性其進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法操作便捷，靈敏度高，其檢測(cè)下限達(dá)到0.167U/mL。
　　(3)基于核酸切刻內(nèi)切酶信號(hào)放大技術(shù)，提出了一種對(duì)糖基化酶進(jìn)行非標(biāo)記

6、熒光檢測(cè)的方法。該方法以尿嘧啶DNA-糖基化酶(UDG)為檢測(cè)模型。通過一條DNA單鏈與另一條含有尿嘧啶堿基和切刻內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的發(fā)卡狀底物探針部分雜交，形成的雙鏈DNA作為UDG作用的底物。由于UDG的作用，尿嘧啶堿基從DNA骨架上移除，從而使得雙鏈底物探針的解鏈溫度降低，在實(shí)驗(yàn)條件下解鏈。釋放出的底物探針3’端形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶以及dNTPs的共同作用下觸發(fā)切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大過程。核酸放大過程產(chǎn)生大量的富鳥

7、嘌呤DNA單鏈，在K+的輔助作用下形成G-四螺旋結(jié)構(gòu)，通過N-甲基卟啉二丙酸IX染料(N-Methyl mesoporphyrin IX，NMM)嵌入G-四螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法將糖基化酶的識(shí)別過程與切刻內(nèi)切酶核酸信號(hào)放大技術(shù)有效地結(jié)合起來，并將G-四螺旋結(jié)構(gòu)與對(duì)其有特異性的NMM染料結(jié)合，從而增強(qiáng)NMM熒光的方法引入該實(shí)驗(yàn)，顯著地增強(qiáng)了檢測(cè)靈敏度。發(fā)展的這種非標(biāo)記熒光手段操作方便，可以高效、靈敏度的用于UDG的測(cè)定，其檢測(cè)下限為