基于納米金和酶切信號放大的生物傳感分析方法及應用研究.pdf

1、隨著分析科學的不斷發(fā)展，生命科學領域中的各種分析和檢測過程越來越多地需要要借助于生物傳感技術獲取所需的信息。生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復雜體系中進行在線連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點，在化學、生物醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品、醫(yī)藥和軍事等領域有重要的應用價值。理想的生物傳感器對目標物應該具有非常高的檢測靈敏度(低檢測限)，高特異性(低干擾)，寬的動力學檢測范圍，快速響應時間，以及通用性等特點。
　　 功能核酸是基于體外篩

2、選或指數富集配體系統(tǒng)進化法(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)，篩選得到的與生物小分子、蛋白質分子、細胞、金屬離子等高親和力和高特異性結合的DNA或RNA片段。功能核酸通常包括兩大類具有特殊功能的核酸分子：一類具有類似于蛋白酶的催化活性，稱為DNA酶(DNAzymes)，另一類能夠像抗體一樣特異性結合目標分子，稱為核酸適配體(Aptamer)。功

3、能核酸的發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)意義上關于核酸只是遺傳信息存儲和轉運載體的認識，為構建用于各種分析對象的生物傳感體系提供了全新的設計思路和平臺。
　　 靈敏度是衡量生物傳感器性能的最重要參數之一，而單純利用功能核酸結合目標物前后構象變化引起信號的改變，在進一步提高靈敏度方面已經十分有限。近年來，設計新的信號放大方法用于目標物的高靈敏檢測已經引起了研究人員的廣泛關注。提高傳感器靈敏度的方法通常有兩種，一種是降低檢測背景，另外一種是采用信號放

4、大技術。其中，由于信號放大技術在提高靈敏度方面的顯著效果，近年來受到了研究者更為廣泛的關注。
　　 基于以上考慮，綜合文獻報道，本文主要利用信號放大技術在提高生物傳感器的檢測靈敏度方面做了一些工作，主要內容如下：
　　 (1)基于納米金信號放大技術的生物傳感器的研究。利用納米金比表面積大、具有良好生物相容性以及表面核酸高負載量的特點，在第2章提出了一種基于“T-Hg2+-T”特異性強結合作用和納米金信號放大的新型非標記H

5、g2+電化學傳感器。在Hg2＋存在的條件下，連接DNA與電極表面的捕獲探針通過“T-Hg2+-T”相互雜交，然后引入納米金功能化的信號DNA與連接DNA另外一端序列雜交。以亞甲基藍作為電活性物質，由于納米金功能化信號DNA的引入能夠放大檢測信號，因此當進行DPV檢測時，可得到明顯增強的電化學信號。該方法可獲得0.5 nM的檢測限，且選擇性好、操作簡單，并可用于實際樣品的檢測。在第3章，我們基于利用距離決定電磁場(EM)增強作用的指數減弱

6、，即拉曼標記物離納米粒子表面越近，Raman信號越強的原理，發(fā)展了一種基于樹枝狀納米分子結信號放大技術的新型SERS傳感器。以基于GR-5 DNA酶的Pb2+SERS傳感器和基于核酸適配體的腺苷SERS傳感器作為分析模型，驗證了通過層層自組裝形成納米分子實現(xiàn)拉曼信號放大的可行性，以及該設計策略的通用性。為了構建Pb2+SERS傳感器，首先將巰基標記的GR-5 DNA酶組裝在金電極表面，當Pb2+存在時，能夠催化鑲嵌在該DNA酶底物鏈中R

7、NA堿基的水解，使其被剪切為兩部分。金電極表面剩余的核酸片段部分可以和納米金標記的報告探針鏈雜交，通過層層自組裝，納米金之間形成了納米結，拉曼信號得到顯著增強，對Pb2+檢測限可達0.1 nM。為了檢測腺苷，采用目標導致鏈置換構建核酸適配體SERS傳感器。核酸適配體首先與金電極表面的捕獲探針互補雜交被固定在電極表面，當腺苷存在時，與核酸適配體發(fā)生特異性結合，導致其構型發(fā)生變化，從電極表面脫落。然后，捕獲探針可以和納米金標記的報告探針鏈雜

8、交，同樣通過層層自組裝形成納米結，從而導致拉曼信號的顯著增強。該傳感器具有較好的選擇性，檢測下限為50 nM。
　　 (2)基于酶切循環(huán)信號放大技術的生物傳感器的研究?；诤怂崆锌诿改軌蜃R別特異性的雙鏈序列而只酶切其中一條單鏈從而可以實現(xiàn)循環(huán)信號放大的特點，在第4章利用分子信標低背景、高靈敏的優(yōu)點提出了一種新型、能夠實現(xiàn)目標誘導酶切循環(huán)信號放大過程的“Y型”探針用于高靈敏檢測目標DNA，該探針同時具有較強的單堿基錯配識別能力。當

9、目標DNA存在時，可以和輔助探針協(xié)同打開分子信標的發(fā)夾型結構，三者相互雜交形成“Y型”結構，從而形成了切口酶Nt.BbvCI的識別序列。分子信標被核酸切口酶識別切斷后，從傳感系統(tǒng)上游離釋放出來。釋放出的輔助探針和目標DNA可以繼續(xù)和另外一個分子信標進行雜交，同時誘發(fā)第二次酶切循環(huán)。經多次酶切循環(huán)反應后，實現(xiàn)了真正的目標DNA誘發(fā)酶切循環(huán)信號放大，與第一代基于中間標記的直線型信號探針構建的“Y型”探針相比更加靈敏，檢測下限為5 pM。在第

10、5章，我們采用將分子識別和信號報告基團進行分離的設計策略，避免了對DNA酶進行修飾，并采用酶切循環(huán)信號放大技術構建了一種新型熒光催化信標，顯著提高了對目標物的檢測靈敏度。以L-組氨酸作為分析模型，采用DNA酶鏈和底物鏈以聚T連接的一體化DNA酶作為識別基團，L-組氨酸導致底物鏈酶切后的產物序列能夠與作為信號報告基團的分子信標雜交，進一步采用核酸切口酶實現(xiàn)酶切循環(huán)信號放大，實現(xiàn)了對目標物的高靈敏和特異性檢測，檢測限為200 nM。由于DN

11、A酶具有可以循環(huán)剪切的性質，也可以用于酶切信號放大技術。在第6章，我們利用連接反應觸發(fā)DNA酶和催化分子信標信號放大技術，提出了一種零背景、高靈敏的小分子檢測方法。以ATP和NAD+作為分析模型，利用DNA連接酶對生物小分子的高特異性依賴，以連接反應觸發(fā)劈開DNA酶的激活，然后與設計為分子信標的底物鏈雜交，在Zn2+存在的條件下進行DNA酶的酶切循環(huán)反應，實現(xiàn)了對生物小分子高靈敏、高特異性的熒光檢測，其靈敏度和特異性均優(yōu)于以前所報道的傳

12、感器。
　　 (3)基于納米金和酶切循環(huán)雙信號放大的生物傳感器的研究?；诤怂嵬馇忻负图{米金雙重信號放大策略，在第7章提出了一種非標型、高靈敏、高特異性電化學DNA傳感器。該傳感器首先在均相中進行發(fā)夾型探針和目標DNA之間的雜交及酶切反應，避免了電極表面進行酶切所遇到的酶效率降低等缺點，而且該發(fā)夾型探針能夠提供較好的堿基錯配識別能力；然后將酶切產物序列與電極表面的發(fā)夾型捕獲探針雜交，進一步提高了堿基錯配識別能力；最后利用納米金功