基于核酸內(nèi)切酶及RNA連接酶的循環(huán)放大檢測DNA及腫瘤細胞.pdf

1、針對惡性腫瘤等疾病早期檢測方法靈敏度與準確性尚需提高的問題.研究基于核酸內(nèi)切酶及RNA連接酶的循環(huán)放大反應，用于DNA片段和腫瘤細胞的檢測。利用核酸內(nèi)切酶對特定位點的限制性內(nèi)切原理及RNA連接酶的交叉催化自我復制性質(zhì)，設(shè)計常溫循環(huán)放大反應，實現(xiàn)信號放大，從而提高檢測靈敏度。將核酸內(nèi)切酶及RNA連接酶參與的循環(huán)放大與DNA和腫瘤細胞的檢測相結(jié)合，提高了檢測的靈敏度，同時降低了檢測限，實現(xiàn)較低含量DNA片段及腫瘤細胞的高靈敏檢測，為重大疾病

2、的早期診斷提供檢測手段。本論文共分為五章：
　　第一章，概述了DNA的組成與分類、核酸內(nèi)切酶的簡介及作用并簡單介紹了DNA邏輯門，化學發(fā)光分析與熒光化學分析等方法。對RNA連接酶的交叉復制與循環(huán)放大做了說明，對腫瘤細胞的檢測及前景做了介紹。
　　第二章，利用DNA能與其互補鏈雜交或者能特異性的與靶分子結(jié)合的特性，構(gòu)建了多輸入“AND”邏輯門，同時檢測三種靶DNA片段。該邏輯門由G1/G2與11、12、13雜交形成，其中G1自

3、身兩端分別雜交形成頸-環(huán)結(jié)構(gòu)，中間部分與G2的兩端互補使G2也形成凸起結(jié)構(gòu)。當待測的11、12、13存在時，分別與其互補的環(huán)狀單鏈DNA(ssDNA)雜交，引發(fā)循環(huán)反應。對于在包金的納米磁微粒表面修飾相應的DNA鏈P1，通過輸入11、12、13片段，將三環(huán)發(fā)卡狀的G1/G2打開，使G1與金納米磁珠上的發(fā)卡狀DNA鏈P1互補，通過限制性剪切酶的作用，將互補的DNA部分剪斷，形成兩段hemin的適體，通過hemin與適體的特異性結(jié)合，催化l

4、uminol和H2O2化學發(fā)光，得到檢測信號。檢測三種DNA的線性范圍為1.0×10-12M至5.0×10-11M，檢測限為1.2×10-12M。
　　第三章，通過DNA的堿基A與T，G與C互補原理，構(gòu)建DNA“OR”邏輯門，并進一步利用核酸內(nèi)切酶對特定位點的限制性內(nèi)切原理，將核酸內(nèi)切酶參與的循環(huán)放大與DNA邏輯門相結(jié)合，提高DNA邏輯門的靈敏度。作為輸入條件的三段DNA片段11、12、13。當有任意一條DNA存在并且濃度均高于1

5、.0×10-12M的條件下，通過DNA互補作用，產(chǎn)生dsDNA片段。而每一個互補的片段中設(shè)計了特定的限制酶剪切位點，在限制酶的存在下將會剪切成更小的片段，通過設(shè)計的模板與DNA聚合酶的作用，產(chǎn)生出便于檢測的特定DNA序列3，3與帶有熒光基團修飾的DNA鏈互補，通過剪切與磁分離，做熒光檢測，而此過程在DNA內(nèi)切酶與聚合酶等的作用下會不斷循環(huán)，得出對于輸入條件DNA的濃度在1.0×10-12M至5.0×10-11M范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，其

6、檢測限為2.0×10-12M。
　　第四章，研究了RNA連接酶參與的交叉循環(huán)信號放大對于腫瘤細胞的檢測。利用表面修飾了羧基的磁微粒作為DNA的載體，與一端修飾了氨基的Ramos細胞適體S1形成化學鍵，將DNA鏈S1修飾到磁珠表面，并且通過堿基互補配對原理使S1與S2雜交成雙鏈。當加入不同個數(shù)的Ramos細胞時，由于細胞的取代作用，在上清液里分離出不同條數(shù)的S2鏈。當有S2存在時，能與兩條RNA鏈E1、E2形成雜交體，該雜交體具有R