黃單胞菌屬DNA條形碼篩選及其重要致病變種檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、黃單胞菌屬是最為重要的植物病原細(xì)菌屬之一，能夠危害多種重要的糧食及經(jīng)濟(jì)作物，其中有14種為我國檢疫性有害生物。由于屬內(nèi)成員數(shù)目眾多，種下又分為許多致病變種，致使該屬種及種下階元的鑒定存在很大困難。DNA條形碼技術(shù)是一種利用特定的DNA序列來鑒定物種的分子生物學(xué)技術(shù)，具有準(zhǔn)確、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地滿足口岸檢疫及植保機(jī)構(gòu)的工作需求。因此，為了提高在種及種下階元上準(zhǔn)確鑒定黃單胞菌的能力，本研究開展了黃單胞菌屬DNA條形碼技術(shù)研究，同

2、時(shí)為了提高該屬內(nèi)一些重要致病變種的精準(zhǔn)鑒定能力，我們還針對(duì)其開展了數(shù)字PCR檢測(cè)方法研究。
　　(1)黃單胞菌屬DNA條形碼基因篩選以327株不同種或致病變種的黃單胞菌為實(shí)驗(yàn)材料，基于進(jìn)化樹法及遺傳距離法等分別對(duì)16S rRNA基因，cpn60，avrBs2，hrp，hpaA，gyrB和rpoD這7個(gè)候選條形碼基因進(jìn)行了篩選驗(yàn)證及有效性評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明cpn60基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率都要明顯優(yōu)于其他候選基因?；谄錁?gòu)建的系

3、統(tǒng)發(fā)育樹也顯示該基因?qū)S單胞菌屬種及種下階元的區(qū)分鑒定能力最為理想。同時(shí)在barcoding gap分析和best close match測(cè)試中該基因也都表現(xiàn)的最為出色，其種/致病變種間遺傳距離明顯大于種/致病變種內(nèi)遺傳距離，而且對(duì)不同種/致病變種的鑒定正確率達(dá)到了99％以上，是理想的用于區(qū)分鑒定黃單胞菌的條形碼基因。
　　(2)黃單胞菌屬DNA條形碼檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用基于篩選出的DNA條形碼基因及研究獲得的大量序列數(shù)據(jù)，建立了

4、黃單胞菌屬DNA條形碼檢測(cè)技術(shù)體系。同時(shí)利用該體系和多種傳統(tǒng)鑒定方法對(duì)收集到的疑似黃單胞菌分離物及病害樣品進(jìn)行了應(yīng)用驗(yàn)證與比較分析，結(jié)果顯示多種檢測(cè)方法得到的結(jié)果均保持一致，但相比之下，DNA條形碼檢測(cè)方法的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度更高，操作過程也更為簡便快速，易于推廣。
　　(3)黃單胞菌屬重要致病變種檢測(cè)技術(shù)研究以水稻細(xì)菌性條斑病菌、水稻白葉枯病菌以及它們的近緣菌為研究對(duì)象，分別基于細(xì)菌性條斑病菌的假定膜蛋白基因和白葉枯病菌的rhs家族

5、基因建立了這兩種病原菌的特異性數(shù)字PCR檢測(cè)體系。對(duì)方法的特異性、靈敏度及重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)試，并用模擬帶菌水稻種子及真實(shí)種子樣品進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果表明，所建立的兩種方法均能特異性的檢測(cè)出目標(biāo)菌株，且均具有較高的靈敏度及良好的重復(fù)性，在模擬帶菌種子及自然帶菌種子樣品的應(yīng)用驗(yàn)證中也都得到了滿意的結(jié)果。
　　總之，本研究為黃單胞菌屬種及種下階元的準(zhǔn)確鑒定提供了新的可靠的分子識(shí)別方法，對(duì)提高該屬有害生物的鑒定能力，保護(hù)國內(nèi)農(nóng)業(yè)和生態(tài)安全具