重組人透明質(zhì)酸酶藥效學(xué)研究.pdf

1、透明質(zhì)酸(HA)又名玻尿酸,是由N－乙酰氨基葡萄糖與D－葡萄糖醛酸為雙糖單位聚合而成的糖胺聚糖，其雙糖單位中的N－乙酰氨基葡萄糖與D－葡萄糖醛酸以β－1，3糖苷鍵相連，雙糖單位之間則以β－1，4糖苷鍵進行聚合。由于雙糖單位聚合度的差異，導(dǎo)致透明質(zhì)酸的分子量分布較為寬泛，天然的HA主要以高分子透明質(zhì)酸（HMW HA，Mr＞2×106Da）方式存在。分子量是決定HA生物學(xué)功能的重要參數(shù)。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是HMW HA，其高粘彈性是細(xì)胞外

2、基質(zhì)得以抵抗外界壓縮力的根源，依賴于高粘彈性，HMW HA也用于眼科手術(shù)。低分子量透明質(zhì)酸（LMW HA，1×105 Da＜Mr＜2×106 Da）具有良好的保濕性和潤滑性，廣泛用于化妝品；研究發(fā)現(xiàn)，超低分子量透明質(zhì)酸（VLMW HA， Mr＜1×105 Da)具有促血管生成作用、促創(chuàng)傷愈合作用、免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，在機體愈合、免疫增強和腫瘤治療等領(lǐng)域有重要的潛在應(yīng)用價值。因此我們建立了高純度低分子量HA的酶切制備法：依賴rHuP

3、H20酶解特性，利用GPC法測定酶解產(chǎn)物分子量，建立酶解產(chǎn)物分子量變化與酶解時間的動力學(xué)模型,調(diào)控酶解反應(yīng)，獲取特定分子量的 HA以滿足不同的臨床需求，同時也為進一步探究體內(nèi)酶解反應(yīng)行為和功能研究提供有效和重要的線索。
　　透明質(zhì)酸酶（HAase）是專一性催化降解HA的酶的統(tǒng)稱，部分HAase也可以在一定程度上降解軟骨素和硫酸軟骨素。人源性HAase主要有三種：HAase1、HAase2和 PH20，其中PH20是降解人體內(nèi)HA的

4、主要酶類。本實驗室建立了大規(guī)模重組人透明質(zhì)酸酶（rHuPH20）的生產(chǎn)流程，并設(shè)定一系列的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)以確保制備高純度的rHuPH20，為后續(xù)藥效學(xué)研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　皮下注射是經(jīng)典的微量體積注射方式，注射液必須經(jīng)由皮膚間質(zhì)進入到作用靶點，而這種由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白和透明質(zhì)酸等結(jié)構(gòu)性大分子組成的皮膚間質(zhì)，具有復(fù)雜三維立體結(jié)構(gòu)，限制了皮下注射藥物的擴散速率和輸液量。其中HA是皮膚間質(zhì)復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的“基架”，同時

5、HA的親水性促使水分子嵌入到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部，構(gòu)建成網(wǎng)狀實體彈性結(jié)構(gòu)，阻礙了流體在皮膚間質(zhì)中流動，阻礙了注射液的擴散吸收。本實驗以裸鼠為研究對象，以臺盼藍模擬聯(lián)用藥物作為可視化的示蹤劑，rHuPH20顯著提高皮下注射給藥的擴散速率；以新西蘭兔為實驗對象，皮下注射大體量生理鹽水制造皮下水腫模型，造模前預(yù)注rHuPH20，在不產(chǎn)生組織損傷條件下，顯著性提高皮下注射輸液量；造模后注射rHuPH20，局部皮下水腫逐漸減小，20分鐘后水腫消失，表明r

6、HuPH20可以有效治療局部皮下水腫；以SD大鼠為研究對象，rHuPH20與NGF聯(lián)用滴鼻給藥可促進NGF入腦效率，顯著增加NGF經(jīng)鼻入腦速率和在各腦組織中的分布，對創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)中樞性疾病的治療具有重大潛在應(yīng)用價值。
　　皮膚間質(zhì)中HA的半衰期只有15-20小時，意味著注射部位的皮膚間質(zhì)在24小時內(nèi)會恢復(fù)損傷，不產(chǎn)生任何組織變化和炎癥表征。rHuPH20的體內(nèi)的半衰期只有10分鐘，極短的半衰期意味著幾乎不會引起組織損傷和炎癥

7、反應(yīng)。同時rHuPH20是人源性透明質(zhì)酸酶，具有底物專一性，對聯(lián)用藥物和組織中其它蛋白無作用，rHuPH20良好的兼容性確保了臨床用藥的安全性。
　　rHuPH20作為擴散劑輔助皮下注射是一種新型的“大體量皮下給藥方式”，相比于靜脈注射，具有技術(shù)要求低、操作簡單、成本低廉和輸液效率高等優(yōu)勢，可替代靜脈注射成為慢性疾病患者自助型注射類藥物給藥方式，例如糖尿病患者注射胰島素；替代不便于靜脈注射環(huán)境和條件的大體量注射方式，例如皮膚燒傷患