重組人微小纖溶酶原的中試及藥效學(xué)研究.pdf

1、玻璃體后脫離(Posterior Vitreous Detachment，PVD)是糖尿病視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜靜脈阻塞的常見并發(fā)癥，老年及近視人群中也有較高的發(fā)病率。玻璃體切割、視網(wǎng)膜復(fù)位是有效治療手段，但手術(shù)并發(fā)癥較高，效果不夠理想。不少臨床研究表明：手術(shù)前，以少量纖溶酶降解玻璃體與視網(wǎng)膜連接處蛋白質(zhì)，可明顯減少手術(shù)引起的視網(wǎng)膜出血、脫離等并發(fā)癥。 視網(wǎng)膜靜脈阻塞是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的第二大視網(wǎng)膜血管疾病，是導(dǎo)致視力喪失的主

2、要原因之一。目前的系統(tǒng)溶栓療法雖起到一定的治療效果，但易引起廣泛的出血，不宜推廣應(yīng)用。且臨床使用的溶栓藥物多為纖溶酶原激活劑，需激活纖溶酶原(Plasminogen，Plg)為纖溶酶(Plasmin，Plm)后才能發(fā)揮溶栓作用。然而，由于栓塞局部的纖溶酶原無法得到及時補充，從而使溶栓效果不理想，血管再通率不高。本研究研制微小纖溶酶防治眼科疾病。 人纖溶酶是絲氨酸蛋白酶超家族的成員之一，不僅可降解血栓中的纖維蛋白，發(fā)揮溶栓作用，而

3、且還可降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與炎癥、組織重建、排卵、腫瘤細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程。人纖溶酶原是一種由791個氨基酸殘基構(gòu)成的糖蛋白，分子量約92 kDa。在堿性條件(pH 11.0)下，纖溶酶限制性降解纖溶酶原．Arg530-Lys531位上的肽鍵，生成含261個氨基酸殘基的微小纖溶酶原(microplasminogen，μPlg)。它不包含人纖溶酶原N端多肽、五個同源的三角區(qū)(K1-K5)，但保留了纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶(SP)

4、活性區(qū)，可被纖溶酶原激活劑激活后形成微小纖溶酶，具有纖溶活性，受a2-抗纖溶酶(a2-antiplasmin，a2-AP)的抑制作用很小。 本實驗室采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建了含人纖溶酶原546-791位間246個氨基酸殘基的重組人微小纖溶酶原(recombinant human microplasminogen，rh—μPlg)編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化甲醇營養(yǎng)型壁赤酵母GS115，獲得了rh—uPlg高效分泌性表達(dá)。本研究在已獲得

5、rh-μPlg高效表達(dá)菌的基礎(chǔ)上，建立了快速、簡便、高效的中試工藝。采用7.5 L發(fā)酵罐，工程菌密度OD600在200以上，發(fā)酵液經(jīng)超濾、凝膠過濾和離子交換層析三步純化，可獲得純度為95％以上的rh-μPlg，產(chǎn)率達(dá)200 mg/L培液。還原性SDS-PAGE顯示rh-μPlg表觀分子量為32 kDa，質(zhì)譜測定其分子量為27 787 Dalton，等電點為pH 7.5-7.8。經(jīng)尿激酶激活后，以三肽底物S2390(NH2-D-Val-P

6、he-Lys-p-nitroanilide)測定比活性為23.6 U/mg，Kcat/Km為127.8740±0.01 mM-1s-1，而人血漿提取的纖溶酶原的比活性、Kcat/Km分別18.2 U/mg．94.15+0.03 mM-1s-1。將得到的rh-uPlg純品在體外與重組人組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)以摩爾比200：1比例混合，37℃孵育40分鐘，注入于兔眼玻璃體腔后部，分別在注藥后1天、7天，以掃描電鏡、大體檢查、眼部

7、B超及相干光斷層掃描(OCT)檢測完全性玻璃體后脫離的發(fā)生。結(jié)果表明：玻璃體腔注入0.5、1.0、1.5 U微小纖溶酶后1天，可分別誘導(dǎo)25％、75％、82.5％的兔眼后極部、赤道部玻璃體皮質(zhì)完全性脫離：玻璃體注入1.0 U纖溶酶后1天，可誘導(dǎo)66.7％兔眼完全性玻璃體后脫離。各注藥眼在治療后1天，其視網(wǎng)膜電圖a波、b波振幅都出現(xiàn)了顯著下降，3天、7天時逐漸恢復(fù)，至第7天與對照組無顯著差別；而a波、b波的延遲期與對照組皆無顯著差異。HE

8、染色顯示各注藥眼的視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，與對照眼無明顯差別。 SD大鼠實驗研究顯示了同樣的結(jié)果。免疫熒光組織化學(xué)檢測顯示：SD大鼠對照眼玻璃體視網(wǎng)膜界面纖連蛋白(FN)主要分布于內(nèi)界膜與玻璃體后皮質(zhì)的錨合位點，層粘連蛋白(LN)除分布于錨合位點以外，還均一分布于內(nèi)界膜的致密板或透明板。在微小纖溶酶誘導(dǎo)的完全性玻璃體后脫離大鼠眼中，玻璃體與視網(wǎng)膜間錨合位點處的FN、LN被降解，而致密板或透明板中的LN無明顯降解。表明：微小纖溶酶

9、對SD大鼠玻璃體與視網(wǎng)膜間錨合位點FN、LN的降解誘導(dǎo)完全性玻璃體后脫離。 玻璃體內(nèi)注射微小纖溶酶溶栓尚能有效治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞。用光化學(xué)法建立SD大鼠視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型。激光照射后1小時，眼底觀察及視網(wǎng)膜血管造影皆顯示視網(wǎng)膜靜脈血流中斷。造模后1天，組織化學(xué)檢測證實阻塞部位有血栓形成，周邊組織排列紊亂，透射電鏡顯示雙極細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞皆發(fā)生了自溶。對造模成功的大鼠，玻璃體內(nèi)注射0.04 U微小纖溶酶，7天后視網(wǎng)膜血管造影顯示血