重組人gapM1的中試和藥效學的初步研究.pdf

1、近期的研究顯示：脂肪組織不僅是一個被動的能量儲存的器官，它還是一個調節(jié)機體內分泌、能量代謝及炎癥的內分泌器官。在前脂肪細胞向脂肪細胞分化的過程中，脂肪組織可以分泌多種激素和細胞因子，這些分泌蛋白通稱為脂肪細胞因子，包括瘦素(leptin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、白介素-6(in

2、terleukin-6)、抵抗素(resistin)、脂聯(lián)素(adiponectin，Acrp30)。脂聯(lián)素是一種重要的脂肪細胞因子家族成員，在血中有較高的濃度(5.30ug/mL)，幾乎占血漿總蛋白的0.01％。脂聯(lián)素具有促進血漿游離脂肪酸氧化、增加外周組織對胰島素的敏感性、抑制肝糖原輸出、抗動脈粥樣硬化等功能。盡管脂聯(lián)素僅由脂肪組織分泌，但在肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和冠狀動脈粥樣硬化性等多種疾病的患者的體內，脂聯(lián)素循環(huán)水平反而明

3、顯降低。 人脂聯(lián)素基因位于3q27，長約17 kb，包含3個外顯子和2個內含子。脂聯(lián)素基因編碼一個247個氨基酸的分泌蛋白，包含4個結構域：氨基端的信號序列、一段非同源序列、由22個Gly-X-Pro或Gly-X-X重復單位組成的膠原結構域和羧基端的球形結構域。球狀結構域為該蛋白質的活性部位，因其球狀結構域與補體C1q蛋白存在序列同源性，故脂聯(lián)素屬于C1q蛋白質家族。在體內循環(huán)時，脂聯(lián)素以全長蛋白(adiponectin)和經(jīng)蛋

4、白水解成的C端球狀結構域(gapM1)的形式存在，后者比前者具有增強的生物學活性。 本室已構建了重組表達人gapM1的巴斯德畢赤酵母工程菌，利用30L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵。待溶氧快速上升，基礎培養(yǎng)基中甘油耗盡時開始補加50％甘油溶液，時間2～3h，至OD600=120左右時停止補加甘油，待其完全耗盡時立即開始補加甲醇誘導gapM1的表達，目的蛋白主要呈分泌型表達。甲醇誘導后有Mr約為17000大小的目的蛋白表達。免疫印跡結果進一

5、步表明，其具有人gapM1的抗原性，誘導時間為24h。誘導結束后離心收集上清，經(jīng)過超濾濃縮、凝膠過濾和離子交換后，得到純度大于95％的重組人gapM1。該重組蛋白能夠使成熟肌肉細胞的脂肪酸氧化增加，能降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體重，并能降低四氧嘧啶誘導的小鼠高血糖模型的血糖水平。 本課題在巴斯德畢赤酵母中成功表達了人gapM1蛋白，經(jīng)純化后得到具有生物學活性的蛋白。重組人gapM1的研制為臨床對肥胖癥、2型糖尿病和動脈粥樣硬化