重組人gapM1的中試和藥效學(xué)的初步研究.pdf

1、近期的研究顯示：脂肪組織不僅是一個(gè)被動(dòng)的能量?jī)?chǔ)存的器官，它還是一個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌、能量代謝及炎癥的內(nèi)分泌器官。在前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中，脂肪組織可以分泌多種激素和細(xì)胞因子，這些分泌蛋白通稱為脂肪細(xì)胞因子，包括瘦素(leptin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、白介素-6(in

2、terleukin-6)、抵抗素(resistin)、脂聯(lián)素(adiponectin，Acrp30)。脂聯(lián)素是一種重要的脂肪細(xì)胞因子家族成員，在血中有較高的濃度(5.30ug/mL)，幾乎占血漿總蛋白的0.01％。脂聯(lián)素具有促進(jìn)血漿游離脂肪酸氧化、增加外周組織對(duì)胰島素的敏感性、抑制肝糖原輸出、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能。盡管脂聯(lián)素僅由脂肪組織分泌，但在肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性等多種疾病的患者的體內(nèi)，脂聯(lián)素循環(huán)水平反而明

3、顯降低。 人脂聯(lián)素基因位于3q27，長(zhǎng)約17 kb，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。脂聯(lián)素基因編碼一個(gè)247個(gè)氨基酸的分泌蛋白，包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域：氨基端的信號(hào)序列、一段非同源序列、由22個(gè)Gly-X-Pro或Gly-X-X重復(fù)單位組成的膠原結(jié)構(gòu)域和羧基端的球形結(jié)構(gòu)域。球狀結(jié)構(gòu)域?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)的活性部位，因其球狀結(jié)構(gòu)域與補(bǔ)體C1q蛋白存在序列同源性，故脂聯(lián)素屬于C1q蛋白質(zhì)家族。在體內(nèi)循環(huán)時(shí)，脂聯(lián)素以全長(zhǎng)蛋白(adiponectin)和經(jīng)蛋

4、白水解成的C端球狀結(jié)構(gòu)域(gapM1)的形式存在，后者比前者具有增強(qiáng)的生物學(xué)活性。 本室已構(gòu)建了重組表達(dá)人gapM1的巴斯德畢赤酵母工程菌，利用30L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。待溶氧快速上升，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50％甘油溶液，時(shí)間2～3h，至OD600=120左右時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)gapM1的表達(dá)，目的蛋白主要呈分泌型表達(dá)。甲醇誘導(dǎo)后有Mr約為17000大小的目的蛋白表達(dá)。免疫印跡結(jié)果進(jìn)一

5、步表明，其具有人gapM1的抗原性，誘導(dǎo)時(shí)間為24h。誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集上清，經(jīng)過(guò)超濾濃縮、凝膠過(guò)濾和離子交換后，得到純度大于95％的重組人gapM1。該重組蛋白能夠使成熟肌肉細(xì)胞的脂肪酸氧化增加，能降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重，并能降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠高血糖模型的血糖水平。 本課題在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá)了人gapM1蛋白，經(jīng)純化后得到具有生物學(xué)活性的蛋白。重組人gapM1的研制為臨床對(duì)肥胖癥、2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化