芽孢桿菌AH-E-1抗真菌肽的分離純化、性質(zhì)及產(chǎn)生條件研究.pdf

1、 芽孢桿菌 芽孢桿菌 AH-E-1 抗真菌肽的分離純化、性 抗真菌肽的分離純化、性質(zhì)及產(chǎn)生條件研究 質(zhì)及產(chǎn)生條件研究 Isolation, purification, characterization and producing conditions of the antifungal peptides produced by Bacillus sp. AH-E-1 學(xué)科專業(yè)： 制藥工程 研 究 生： 陳娜 指導(dǎo)教師： 曲紅梅 副教授

2、 企業(yè)導(dǎo)師： 李君文 研究員 天津大學(xué)化工學(xué)院 二零一二年五月 摘 要 真菌引起的病害日益嚴(yán)重， 芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗真菌物質(zhì)而受到人們的重視。芽孢桿菌 AH-E-1 為一株新發(fā)現(xiàn)的菌株，前期研究表明它能有效抑制白色念珠菌。為進(jìn)一步研究它的抗真菌活性和尋找新的抗真菌物質(zhì)，本文對(duì)芽孢桿菌AH-E-1 及其發(fā)酵上清液進(jìn)行研究，并對(duì)其產(chǎn)生的抗真菌肽的分離純化和性質(zhì)進(jìn)行研究，最后對(duì)產(chǎn)生抗真菌肽的發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化。研究?jī)?nèi)容如下： 采用對(duì)峙法

3、、覆蓋法、插片法等對(duì)芽孢桿菌AH-E-1及其發(fā)酵上清液的抗菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌株能顯著抑制13種植物致病真菌及11種人類致病真菌；該菌株能引起真菌菌絲扭曲等變形；其產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)存在于發(fā)酵上清液中，該發(fā)酵上清液能抑制絲狀真菌孢子萌發(fā)及芽管和菌絲生長(zhǎng)，與1mol/mL的兩性霉素B相比該發(fā)酵上清液對(duì)白色念珠菌抑制作用更強(qiáng)。 通過硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑萃取、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀和甲醇浸取對(duì)抗真菌物質(zhì)進(jìn)行粗提， 經(jīng)比較其效果選用甲醇浸取

4、對(duì)抗真菌物質(zhì)進(jìn)行粗提。 通過水合茚三酮等實(shí)驗(yàn)對(duì)抗真菌物質(zhì)進(jìn)行了初步定性。 通過對(duì)抗真菌肽的三種分離純化路線進(jìn)行比較，選用超濾、反相色譜及 HILIC 色譜對(duì)抗真菌肽進(jìn)行分離純化，獲得了色譜級(jí)的抗真菌肽。研究表明：抗真菌物質(zhì)為肽類物質(zhì)，其分子量約為500~1000Da，極性很強(qiáng)，不可電離，具有熱穩(wěn)定性、抗紫外線性和耐酸堿性，能耐氯仿等 5 種有機(jī)溶劑，并且對(duì)胰蛋白酶(1mg/mL)等 6 種酶穩(wěn)定。 通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)芽孢桿菌AH-E

5、-1產(chǎn)生抗真菌肽的發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化， 研究表明抗真菌肽的產(chǎn)生受多種因素影響， 其中碳氮比增加有利于該抗真菌肽的產(chǎn)生，培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量和培養(yǎng)基初始pH這5個(gè)因素對(duì)該芽孢桿菌產(chǎn)生抗真菌肽的影響大小依次為：培養(yǎng)基>發(fā)酵時(shí)間>裝液量=接種量>培養(yǎng)基初始pH。較佳搖瓶發(fā)酵條件為：在500mL三角錐瓶中加入150mL初始pH值為7.0的PDB（200）培養(yǎng)基，接入10%的芽孢桿菌AH-E-1液體菌種，在37℃下