地衣芽孢桿菌HS10抗真菌蛋白的分離純化及其生物學(xué)性狀分析.pdf

1、黃瓜霜霉病是由真菌門（Eumycota）、鞭毛菌亞門(Mastigomycotina)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉科(Peronosporales)、古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostov]侵染引發(fā)的一種常見氣傳真菌病害，是世界70個(gè)國(guó)家的黃瓜產(chǎn)區(qū)的重要葉部病害之一，嚴(yán)重影響黃瓜的生產(chǎn)。目前，黃瓜霜霉病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，如乙磷鋁、百菌清、甲霜靈、霜霉威甲霜

2、靈、代森錳鋅，但其防病效果不佳，對(duì)環(huán)境污染也較為嚴(yán)重。而生物防治是一種安全、綠色的防治方法，潛力巨大，逐漸受到人們的關(guān)注。
　　芽孢桿菌屬是一種常見的優(yōu)勢(shì)微生物種群，廣泛分布于土壤和植物體內(nèi)。它具有穩(wěn)定的定殖能力和對(duì)植物抑菌防病增產(chǎn)的能力。地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中具有應(yīng)用潛力的菌株之一，其代謝系統(tǒng)發(fā)達(dá)，胞外抗菌物質(zhì)豐富。
　　菌株HS10分離于江蘇省淮安市丁集健康黃瓜根圍。經(jīng)對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，鑒定為地衣芽孢桿

3、菌Bacillus licheniformis（NCBI中GENBANK登錄號(hào)為Bacillus licheniformis HM006898.1）。前期實(shí)驗(yàn)中，地衣芽孢桿菌HS10在平板實(shí)驗(yàn)中顯示很好的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶的酶活活性;同時(shí)HS10是一株對(duì)黃瓜霜霉病具有良好防效的生防菌，溫室防效和田間防效達(dá)到61.96％、62.31％。
　　利用地衣芽孢桿菌HS10進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，平板抑菌圈法檢測(cè)HS10發(fā)酵產(chǎn)物的抑真菌活性。

4、不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間后，使用不同飽和度的硫酸銨對(duì)HS10菌株發(fā)酵液中粗蛋白進(jìn)行鹽析，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)為48小時(shí)、硫酸銨飽和度為30％-60％。利用黃瓜離體葉片進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明蛋白粗提液對(duì)黃瓜霜霉病具有顯著的抑制作用。此外，該蛋白液對(duì)小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥根腐病菌（Bipolaris

5、 sorokinianum）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）都有明顯的抑菌活性。
　　為明確該抗菌蛋白的性質(zhì)，采用硫酸銨沉淀、液相色譜DEAE-Sepharose FastFlow陰離子層析、RESOURCE Q陰離子層析和Sephad

6、exG-75層析純化和SDS-PAGE檢測(cè)，得到大小在55 kDa左右蛋白質(zhì)）。該蛋白具有良好的耐熱性，100℃下作用30 min，仍可保持活性;最佳的pH為7-8;金屬鹽離子和蛋白酶K處理后，抑菌活性沒有明顯影響。顯微鏡觀察下，抗菌蛋白可以導(dǎo)致指示菌辣椒疫霉的菌絲頂端膨大畸形，并出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用色譜分析，進(jìn)行肽譜圖數(shù)據(jù)比對(duì)，分析結(jié)果顯示，覆蓋率最高的檢測(cè)出39條肽鏈，為一種羧肽酶類似蛋白（Protein ID: gi|510