太行菊(Opisthopappustaihangensis)產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的篩選和鑒定.pdf

1、藥用植物內(nèi)生真菌可代謝生成和宿主植物相似的藥用成分，其中抗菌、抗腫瘤內(nèi)生真菌次級代謝物引起廣泛研究。太行菊目前僅局限于分類學(xué)和組織培養(yǎng)等研究，太行菊內(nèi)生真菌目前還未見報道。太行菊中起抗氧化、抗腫瘤和治療心血管疾病的是黃酮類化合物。本研究目的在于篩選產(chǎn)黃酮的太行菊內(nèi)生真菌，并對產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌進行分類鑒定。本論文主要結(jié)果如下：
　?。?）本文對太行葉片采取組織分離法進行了內(nèi)生真菌的分離和篩選，利用菌絲頂端純化法和Z字形劃線法兩種方法對

2、內(nèi)生真菌進行了純化，用試管斜面保存法和無菌水保存法對內(nèi)生真菌進行了保存。實驗結(jié)果表明：最佳的表面消毒方法是75％的酒精消毒45s后再用升汞消毒45s。并且共篩選出太行菊內(nèi)生真菌37株。
　?。?）本文通過使用5種黃酮類化合物顯色劑 AlCl3、硝酸鋁-亞硝酸鈉、NaOH、鹽酸-鎂粉和FeCl3分別對太行菊葉片中分離到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液和菌絲體進行黃酮類物質(zhì)的顯色反應(yīng)。其中，硝酸鋁-亞硝酸鈉是黃酮類化合物的特異性顯色劑，為確定產(chǎn)黃酮

3、菌株的必要條件。選擇包含硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)和其它兩種顯色反應(yīng)陽性的菌株為產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌。顯色反應(yīng)分為兩個方面，包括發(fā)酵液的顯色反應(yīng)和菌絲體的顯色反應(yīng)。將篩選出的發(fā)酵液中有黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌進行菌絲體的顯色反應(yīng)。認(rèn)為發(fā)酵液和菌絲體都含有黃酮類化合物的內(nèi)生真菌為太行菊葉片的產(chǎn)黃酮菌株。結(jié)果表明，產(chǎn)黃酮菌株為：T1，T2，T8，T9，S9，S10，R1，R2。
　?。?）用高效液相色譜法對產(chǎn)黃酮菌株的黃酮類物質(zhì)進行定性和定量分析。本

4、文使用4中黃酮類標(biāo)品：槲皮素、山奈酚、蘆丁和異鼠李素。以純甲醇溶解，進行稀釋后用高效液相儀檢測峰面積和出峰時間，以質(zhì)量濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，只產(chǎn)蘆丁的菌株有T1、T8、R1，只產(chǎn)槲皮素的是 T2，同時產(chǎn)蘆丁和槲皮素的是 R2，而 T9、S9、S10同時產(chǎn)蘆丁、異鼠李素和槲皮素。同時產(chǎn)三種黃酮類物質(zhì)的菌株槲皮素、蘆丁、異鼠李素最高產(chǎn)量分別為0.0116±0.0034mg/ml，0.03

5、74±0.0055mg/ml，0.0460±0.0047mg/ml。這些產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的菌株普遍產(chǎn)蘆丁，且蘆丁含量相對較高，實驗中產(chǎn)黃酮菌株均不含山奈酚。
　?。?）對8株產(chǎn)黃酮類化合物內(nèi)生真菌進行形態(tài)學(xué)鑒定，對菌落形態(tài)、顏色，孢子梗形態(tài)、孢子形態(tài)進行觀察和描述，參考有關(guān)文獻和《半知菌屬圖解》（H.L.巴尼特、B.B.亨特著）以確定8株內(nèi)生真菌的種屬分類地位。
　?。?）本文使用分子生物學(xué)手段對8株內(nèi)生真菌進行了鑒定。利用真菌

6、基因組 DNA提取試劑盒分別對8株內(nèi)生真菌提取了基因組 DNA，本文選取真菌通用引物ITS1和ITS4擴增克隆真菌rDNA的ITS區(qū)段。在瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將 PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進行測序。結(jié)果表明，8株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌擴增出的ITS區(qū)段為500-600bp。
　　將測序得到的序列在Genebank中進行BLAST比對，獲得其同源序列，經(jīng)過BLAST比對得到與該核酸序列同源性由高到低的一系列序列信息。記錄并下載通

7、過與原始序列比對 score值較高的同源系列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析。從而用分子生物學(xué)方法確定產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的種屬地位。結(jié)果表明：產(chǎn)黃酮太行菊內(nèi)生真菌的種屬地位與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，可以確定 T1、T2、T8、T9、S9、S10、R1、R2分別為鐮孢菌屬(Fusarium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、青霉屬(Penicill