痕量銅離子檢測(cè)方法以及檢測(cè)組蛋白甲基化試紙條的構(gòu)建.pdf

1、銅是生物體所必須的微量元素之一，其濃度高低直接影響人們的健康。在人體中銅離子主要以作為許多酶和蛋白（如超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、多巴胺β-羥化酶、酪氨酸酶和銅藍(lán)蛋白等）的催化輔助因子或結(jié)構(gòu)組成部分來(lái)參與細(xì)胞中的新陳代謝過(guò)程，人體僅僅需要微量的銅就可以維持正常的生命活動(dòng)。但是，銅缺乏或銅過(guò)量都會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生不利的影響。銅缺乏一般伴隨著其他營(yíng)養(yǎng)元素的缺乏或者其生物拮抗物質(zhì)的攝取過(guò)量，影響細(xì)胞內(nèi)許多酶的正常功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的新陳代謝過(guò)程

2、。銅過(guò)量通常是由于遺傳性疾病或者由于環(huán)境重金屬銅污染，誤食了大量含銅的食物或吸入了含銅量高的氣體所造成。人類的活動(dòng)造成銅離子的大氣污染和水體污染，最終都會(huì)回歸到土壤中造成土壤污染，進(jìn)而影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。食物中的銅離子通過(guò)食物鏈的逐級(jí)放大過(guò)程，最終進(jìn)入人體，對(duì)人類的健康產(chǎn)生危害。肝臟是儲(chǔ)存銅離子的重要場(chǎng)所，也是銅排入膽汁的重要器官，銅過(guò)量會(huì)影響肝腎的正常代謝，造成胃腸道功能紊亂和溶血性貧血等;過(guò)多的銅離子若在腦、心臟等處沉淀，會(huì)造成

3、神經(jīng)退行性疾病和全身性的癥狀，包括威爾遜氏綜合癥和阿爾茨海默氏癥。鑒于銅離子對(duì)人類健康，生態(tài)系統(tǒng)和食品安全方面會(huì)產(chǎn)生巨大的危害，在檢測(cè)銅離子方面已投入了大量工作。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局規(guī)定飲用水中銅離子的含量不能超過(guò)20μM。
　　傳統(tǒng)的用于檢測(cè)重金屬離子的方法主要有石墨烯原子吸收光譜法和電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法。這兩種方法對(duì)于重金屬離子的檢測(cè)準(zhǔn)確可靠，但使用的儀器價(jià)格昂貴，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員來(lái)操作，因而限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室的廣泛

4、應(yīng)用。近年來(lái)，各種檢測(cè)重金屬離子的生物傳感器不斷出現(xiàn)，包括:熒光法，基于膠體金的比色法和動(dòng)力學(xué)光散射法等。雖然與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，這些方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度高，但是需要用到蛋白酶或者熒光標(biāo)記的核酸，增加了檢測(cè)的成本和反應(yīng)體系的復(fù)雜性。因此，有必要構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)銅離子的生物傳感器。
　　真核生物基因組主要攜帶兩種遺傳學(xué)信息，一類是傳統(tǒng)意義上的遺傳信息，即DNA序列所攜帶的遺傳信息，另一類指的是表觀遺傳學(xué)信息，不涉

5、及DNA序列的改變，是可逆的并且可遺傳的基因表達(dá)調(diào)控。組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，通常發(fā)生在組蛋白N末端賴氨酸和精氨酸殘基上，具有廣泛的生物學(xué)功能，與異染色質(zhì)的形成、X染色體失活、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、干細(xì)胞的維持和分化以及腫瘤的形成有關(guān)，這往往取決于組蛋白被甲基化的位置和甲基化的程度。近年來(lái)，伴隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，一些檢測(cè)組蛋白甲基化的技術(shù)隨之產(chǎn)生，如染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，或與PCR和生物芯片聯(lián)合使用，以及western blo

6、t。這些檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，但操作復(fù)雜，工作量大，因此，構(gòu)建一種操作簡(jiǎn)便的生物傳感器用于組蛋白甲基化的快速檢測(cè)十分必要。
　　本論文基于具有催化活性的脫氧核糖核酸酶構(gòu)建了兩種用于銅離子檢測(cè)的生物傳感器，包括以DNA自組裝的非酶擴(kuò)增熒光生物傳感器以及基于點(diǎn)擊化學(xué)和G四聚體的比色生物傳感器;以單鏈DNA標(biāo)記的膠體金為信號(hào)增強(qiáng)探針，構(gòu)建了一種新型的信號(hào)增強(qiáng)的試紙條生物傳感器，可用于組蛋白甲基化的快速檢測(cè)。具體包括以下三方面的內(nèi)容:

7、　　(1)利用自組裝的雙鏈DNA串聯(lián)體和SYBR GreenⅠ染色法構(gòu)建了非酶擴(kuò)增的銅離子檢測(cè)方法。反應(yīng)機(jī)制基于銅離子能夠特異性地識(shí)別并切斷與銅離子依賴型DNA酶鏈雜交的底物鏈，釋放出的靶核酸能夠啟動(dòng)DNA自組裝為長(zhǎng)的雙鏈DNA，SYBR GreenⅠ染色后檢測(cè)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)信號(hào)的放大不需要使用蛋白酶，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便。對(duì)銅離子的檢測(cè)限為12.8 pM，遠(yuǎn)低于美國(guó)環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的飲用水中最大允許量20μM。
　　(2)利用

8、基于點(diǎn)擊化學(xué)和具有辣根過(guò)氧化物酶活性的G四聚體的比色法構(gòu)建了一種銅離子快速檢測(cè)生物傳感器。在反應(yīng)體系中使用點(diǎn)擊化學(xué)使修飾有疊氮基團(tuán)和炔基基團(tuán)的兩條DNA序列形成G四聚體形成序列，之后加入高鐵血紅素和KCl，形成高鐵血紅素/G四聚體結(jié)構(gòu)。由于高鐵血紅素/G四聚體具有HRP的活性，能催化其無(wú)色底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)形成有顏色的底物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)肉眼就能判別。定量分析時(shí)，將反應(yīng)

9、終溶液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀讀取溶液在450nm的光密度(Optical density,OD)值。對(duì)銅離子檢測(cè)限為5.9 nM，遠(yuǎn)低于美國(guó)環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的飲用水中銅離子濃度的最大允許濃度20μM。檢測(cè)體系簡(jiǎn)單迅速，特異性好，不受其他物質(zhì)的干擾，結(jié)果肉眼可讀，適合在基層實(shí)驗(yàn)室使用。
　　(3)使用核酸標(biāo)記的膠體金作為信號(hào)增強(qiáng)探針，構(gòu)建了一種信號(hào)增強(qiáng)的試紙條生物傳感器可用于組蛋白甲基化的快速、靈敏檢測(cè)。傳感器中用到了兩種帶有不同標(biāo)

10、記的膠體金顆粒:包括標(biāo)記有單鏈DNA的金顆粒（信號(hào)增強(qiáng)探針）和同時(shí)標(biāo)記有單鏈c-DNA和單克隆抗體的金顆粒（雙標(biāo)金顆粒），其中DNA的序列與c-DNA互補(bǔ)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先通過(guò)雙抗夾心法捕獲蛋白，在檢測(cè)線上形成三明治夾心復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，即抗體-蛋白-雙標(biāo)的金顆粒，則檢測(cè)線因?yàn)槟z體金顆粒的聚集而顯紅色。接著，再加入信號(hào)增強(qiáng)探針，這種金顆粒通過(guò)DNA和c-DNA的雜交而被固定在檢測(cè)線區(qū)域，此時(shí)有更多的膠體金聚集，檢測(cè)線的顯色被加深。HeLa細(xì)胞中

11、的組蛋白H3K9m3(tri-methylated lysine9 ofhistone H3)被選來(lái)作為信號(hào)增強(qiáng)的試紙條檢測(cè)的模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法在20 ng的 HeLa細(xì)胞組蛋白提取液中就能檢測(cè)到H3K9me3，比傳統(tǒng)的試紙條和western blot的靈敏度分別提高了10倍和15倍。并且這種信號(hào)增強(qiáng)的試紙條生物傳感器具有普遍適用性，可以用來(lái)檢測(cè)其他類型的組蛋白甲基化，如單甲基化、二甲基化和三甲基化的H3K4和H3K9，以及各種