2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)是一種家蠶常見的致病真菌,其引發(fā)的家蠶微粒子病是蠶桑產(chǎn)業(yè)中毀滅性的病害,因此家蠶微孢子蟲一直被各養(yǎng)蠶國家和地區(qū)列為法定的蠶業(yè)生產(chǎn)檢疫對象。為有效控制蠶業(yè)生產(chǎn)中因家蠶微孢子蟲引發(fā)的家蠶微粒子病,以免其引發(fā)家蠶死亡,如何在成品卵階段完成家蠶微孢子蟲的檢測成為蠶業(yè)科學(xué)研究中的重要工作之一。目前蠶業(yè)生產(chǎn)中常用的家蠶微孢子蟲檢測方法為母蛾鏡檢法,屬于間接檢查,其操作簡單方便、結(jié)果直觀易懂,但由于其對檢

2、測人員要求很高,母蛾樣品準備繁瑣,同時在鏡檢工作中容易將家蠶微孢子蟲與花粉粒、曲霉孢子等混淆,降低了檢測工作的速度和準確度,因此建立直接檢測成品卵中家蠶微孢子蟲的方法已成為蠶業(yè)科學(xué)研究的重點。PCR技術(shù)是分子生物學(xué)實驗室的常用技術(shù)手段,因準確、靈敏的優(yōu)勢成為了臨床及實驗室病原微生物檢測的常用方法。免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測法操作方便快捷,造價低廉,易在基層推廣,目前已在病原微生物或者臨床檢測的工作中占據(jù)了重要的地位。本研究旨在于聯(lián)合核酸擴增

3、技術(shù)與免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l技術(shù)建立一種操作簡單、特異性強、靈敏度高的核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l快速檢測方法,為成品卵中家蠶微粒子病的快速檢測做出貢獻。
  1.家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測體系的建立
  以家蠶微孢子蟲的LSU rRNA作為擴增靶標(biāo),依據(jù)其序列設(shè)計引物,而后以家蠶微孢子蟲基因組為模板通過PCR擴增對引物進行篩選,經(jīng)瓊脂糖核酸電泳選擇擴增效率較高的引物對LSU323及LSU480作為候選引物,隨后對所選引物進行修飾

4、,在上游引物5’端修飾生物素標(biāo)簽,下游引物5’端修飾羧基熒光素。隨后進行無模板的PCR擴增,并利用核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l對產(chǎn)物進行檢測,最終選擇不形成可檢測異源二聚體的引物對LSU323進行后續(xù)實驗,其上游引物為:5’-Biotin-tctgtcacctccaatcaa-3’,下游引物為:5’-FAM-tatgttatttggtagttgtg-3’。通過對四種不同基因組提取方法的比較,最終確定可高效穩(wěn)定提取感染家蠶微粒子蠶卵基因組的NPT裂

5、解法作為后續(xù)實驗的提取方法;隨后對不同DNA聚合酶進行測試,最終選擇抗逆性較強,擴增效果較好的Mighty Amp?DNA Polymerase為后續(xù)所用聚合酶,并對最佳擴增條件進行了確定。本檢測方法能把家蠶微孢子蟲與家蠶其他常見病原,如粘質(zhì)沙雷氏菌、家蠶核型多角體病毒、金黃色葡萄球菌、球孢白僵菌區(qū)分開來,且對于家蠶微孢子蟲DNA的檢測限度為10pg,對模擬家蠶微孢子蟲感染蠶卵的檢測限度為10spores/100粒蠶卵,此結(jié)果說明本檢測

6、方法的特異性和靈敏度均能滿足蠶業(yè)生產(chǎn)的要求。與傳統(tǒng)的家蠶微孢子蟲分子生物學(xué)檢測方法相比,本檢測方法的DNA提取方法快捷高效,所得產(chǎn)物無需純化即能直接用于檢測,大大簡化了樣品處理的步驟,從樣品準備到得到最終結(jié)果總耗時約120 min。
  2.家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鰴z測試紙條的應(yīng)用
  使用家蠶微孢子蟲核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測帶毒母蛾及對應(yīng)的帶毒蠶卵、成品卵(原種及雜交一代種)、4株生產(chǎn)中分離的家蠶微孢子蟲分離株。檢測結(jié)果顯示

7、核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l能檢測帶毒母蛾及對應(yīng)的帶毒蠶卵。檢測的29個原種蠶卵樣品,其對應(yīng)母蛾鏡檢陽性率100%,生產(chǎn)蟻蠶補正檢查陽性率17%,用核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測,其陽性率為31%;檢測的67雜交一代種個樣品,其對應(yīng)的集團母蛾鏡檢陽性率100%,經(jīng)催青收蟻開展的補正檢查陽性率49%,采用我們建立的核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l方法,其檢測陽性率77%。通過對從生產(chǎn)中分離的4株家蠶微孢子蟲分離株的檢測發(fā)現(xiàn),可以檢測出其中3株?;诤怂醾?cè)層析試紙條檢測結(jié)

8、果可知該方法可以有效應(yīng)用于生產(chǎn)中家蠶微孢子蟲感染蠶卵的檢測,經(jīng)改良后也能用于感染母蛾的檢測。通過對核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l及瓊脂糖凝膠電泳的檢測結(jié)果的對比,可知核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l呈陽性結(jié)果的樣品在使用瓊脂糖凝膠電泳檢測時同樣也顯示大小正確,條帶單一的陽性結(jié)果,證明了核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測方法的可靠性,重現(xiàn)性好。與傳統(tǒng)的母蛾鏡檢法相比,核酸側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測方法能夠直接用于蠶卵的檢測,其結(jié)果更加客觀公正,且本方法不依賴檢測人員的視力差異,也不受

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