通過環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測空腸彎曲桿菌和幽門螺桿菌.pdf

1、目的：
　　建立一種基于DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測空腸彎曲桿菌和幽門螺桿菌的方法，并對(duì)該方法檢測兩種細(xì)菌的特異性及敏感性加以驗(yàn)證。
　　方法：
　　1.以空腸彎曲桿菌馬尿酸酶基因(HipO基因)、幽門螺桿菌尿素酶B基因(UreB基因)為靶序列分別設(shè)計(jì)特異性引物5-6套;
　　2.通過比較各引物的擴(kuò)增效率分別篩選出針對(duì)空腸彎曲桿菌和幽門螺桿菌擴(kuò)增效率較高的引物組合;
　　3.以其他菌株和

2、ddH2O作為對(duì)照，對(duì)備選引物按照擴(kuò)增效率高低逐一進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，直至2種細(xì)菌各選出1套擴(kuò)增效率高且特異性好的最佳引物組合;
　　4.分別篩選出兩種細(xì)菌LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度;
　　5.將細(xì)菌DNA模板原液用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋，判定LAMP法檢測空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌的敏感性。
　　6.用LAMP法分別檢測50例腹瀉患者糞便樣本中的空腸彎曲桿菌和80例胃液樣本中的幽門螺桿菌，對(duì)LAMP法檢測兩種細(xì)菌陽性

3、率、靈敏度、特異度與其他常用方法進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.空腸彎曲桿菌LAMP反應(yīng)最佳引物組合為CJ-5，幽門螺桿菌LAMP反應(yīng)最佳引物組合為HPUB-3，反應(yīng)均在60min內(nèi)完成;
　　2.LAMP法的特異性檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中選取的兩組特異性引物能分別使空腸彎曲桿菌和幽門螺桿菌發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，而不能使其他菌株和ddH2O發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng);
　　3.LAMP法的敏感性檢測結(jié)果顯示，空腸彎曲桿菌的最低檢出限為6.

4、97×102拷貝/μl，幽門螺桿菌的最低檢出限為2.61×103拷貝/μl;
　　4.應(yīng)用LAMP法對(duì)50例腹瀉患者糞便樣本進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌，與PCR法結(jié)果一致;應(yīng)用LAMP法對(duì)80例胃液樣本中幽門螺桿菌進(jìn)行檢測，其陽性檢出率為41.25％，靈敏度為94.3％，特異度為95.7％，與PCR法、病理組織學(xué)檢查及13C呼氣試驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究以HipO基因、UreB