環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測變形桿菌屬的研究.pdf

1、分類號：至S：2Q2：壘密級：公玨單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號：2QQ墨152環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測變形桿菌屬的研究ApplicationofLoopMediatedIsothermalAmplification(LAMP)inRapidDetectionofProteus學(xué)位申請人：王鵬指導(dǎo)教師：張偉教授學(xué)科專業(yè)：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二O一一年五月二十九日物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同

2、大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。另外，在反應(yīng)中添加特異性環(huán)引物(100pprimer)能夠把擴(kuò)增時間縮短到原來的一半，使反應(yīng)速率極大地得到提高。近年來LAMP技術(shù)以其特異性強(qiáng)、等溫、靈敏、操作簡單、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域的多個方面。本研究針對變形桿菌屬atpD基因序列(AXl09601)進(jìn)行分析，設(shè)計6條引物f2條內(nèi)引物、2條外引物、2條環(huán)引物)，對普通變形桿菌和奇異變形桿菌進(jìn)行檢測，優(yōu)化反應(yīng)條件，驗(yàn)證檢測的特異性和靈敏

3、度，應(yīng)用于食品樣品的直接檢測，并用限制性內(nèi)切酶Pspl406I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察酶切片段大小，驗(yàn)證方法的正確性，建立了變形桿菌屬的LAMP檢測方法。為了確立最佳反應(yīng)條件我們對LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)表明溫度是LAMP的最大影響因素，而鎂離子和引物濃度比對反應(yīng)影響不大。從而獲知外環(huán)內(nèi)引物濃度比為1：2：6、Mg添加濃度為20mmol／L、反應(yīng)溫度為61℃、反應(yīng)時間為50min時檢測最靈敏。為評價該技術(shù)的特異性，我們同時對1株普通變

4、形桿菌、1株奇異變形桿菌和13株其它腸桿菌致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果表明僅變形桿菌屬DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳后出現(xiàn)特異的梯狀條帶，進(jìn)一步對該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，結(jié)果也與預(yù)期相符。這表明LAMP技術(shù)對變形桿菌屬DNA的擴(kuò)增是特異的。我們對原始模板進(jìn)行梯度稀釋來測試其敏感性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LAMP技術(shù)可以穩(wěn)定檢出變形桿菌DNA的下限為54CFU／mL。應(yīng)用LAMP方法對豬肉樣品進(jìn)行變形桿菌DNA檢測，并將結(jié)果與普通PCR法相比較。結(jié)果顯示，LAMP