生長抑素對小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制.pdf

1、本文研究了生長抑素對小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：Balb/C小鼠胰島、胰腺外分泌細(xì)胞分離、純化及功能檢測。
　　目的：Balb/c小鼠胰島的分離純化。
　　方法：采用逆行膽胰管灌注V型膠原酶的方法來消化分離Balb/C小鼠胰島，單一濃度梯度淋巴細(xì)胞分離液（10771）及倒置顯微鏡下手工篩選純化胰島，DTZ（雙硫腙）特異性染色監(jiān)測胰島產(chǎn)量及純度，臺盼藍(lán)染色計(jì)算胰島細(xì)

2、胞的活性，通過ELISA試劑盒計(jì)算胰島素刺激指數(shù)以檢測胰島功能。胰腺外分泌細(xì)胞體外功能檢測，收集上清液ELISA法測定胰蛋白酶含量。
　　結(jié)果：純化后的每只Balb/C小鼠可獲150左右個(gè)高質(zhì)量的胰島，活性及純度均大于90％，葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)表明胰島功能基本正常。胰腺外分泌細(xì)胞培養(yǎng)1h，4h后取上清液胰蛋白酶含量為（5.8±1.2）ng/ml,（7.3±1.0）ng/ml。
　　結(jié)論：應(yīng)用本課題組成熟的實(shí)驗(yàn)方法，能夠

3、獲得高純度、高質(zhì)量的胰島及胰腺外分泌細(xì)胞以滿足下一步胰島移植后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。
　　第二部分：Balb/C糖尿病小鼠左腎被膜下純胰島移植及與胰腺外分泌細(xì)胞共同移植動(dòng)物模型的建立。
　　目的：掌握本課題組建立Balb/C糖尿病小鼠左腎被膜下純胰島移植及與胰腺外分泌細(xì)胞共同移植動(dòng)物模型的方法及探討研究胰腺外分泌細(xì)胞對移植胰島的損傷作用。
　　方法：Balb/C雄性小鼠腹腔內(nèi)注射STZ（鏈脲佐菌素）誘導(dǎo)成為1型糖尿病小鼠。單純

4、移植組（n=10）在每只受鼠左腎被膜下移植胰島細(xì)胞團(tuán)250個(gè)，共同移植組（n=10）在每只受鼠左腎被膜上下兩極同步移植胰島細(xì)胞團(tuán)250個(gè)和等體積的胰腺外分泌細(xì)胞，移植術(shù)后持續(xù)監(jiān)測小鼠尾靜脈血糖的變化，一個(gè)月后左腎切除，免疫組織化學(xué)染色法觀測抗胰島素抗體及抗胰蛋白酶抗體的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴胰島移植后，共同移植組較單純組血糖恢復(fù)正常時(shí)間延遲2-3天，兩組移植后的糖尿病小鼠血糖均逐步恢復(fù)正常。⑵單純及共同移植組在腎被膜下可見大量抗胰島

5、素抗體陽性顯色，證實(shí)為移植胰島。共同移植組胰島細(xì)胞團(tuán)周圍可見大量的抗胰蛋白酶抗體陽性顆粒，而單純移植組未見明顯的陽性顆粒。⑶胰腺外分泌細(xì)胞和胰島細(xì)胞團(tuán)共同移植后，證實(shí)胰腺外分泌細(xì)胞可釋放大量的胰蛋白酶損傷移植胰島的功能恢復(fù)。
　　結(jié)論：①選取誘導(dǎo)糖尿病模型的小鼠體重量大于26g,以1.75mg/kg腹腔內(nèi)注射可以誘導(dǎo)糖尿病模型。②成功建立了胰島和胰腺外分泌細(xì)胞共同移植的動(dòng)物模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供前期動(dòng)物模型準(zhǔn)備工作。
　　第三

6、部分：生長抑素對小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　目的：探討生長抑素如何減輕小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細(xì)胞對移植胰島的損傷及其促進(jìn)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　方法：⑴體外實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選取雄性BALB/C小鼠30只，獲取胰島和胰腺外分泌細(xì)胞，隨機(jī)分組及短期共同培養(yǎng)后，采用流式細(xì)胞術(shù)儀檢測凋亡、測定上清液中胰蛋白酶含量及檢測胰島的胰島素含量和刺激指數(shù)、外分泌細(xì)胞及胰島細(xì)胞涂片后采用TUNEL染色檢測細(xì)

7、胞凋亡和免疫組化測定P53蛋白。⑵體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用膽總管內(nèi)逆行灌注膠原酶的方法分別分離、純化胰腺外分泌細(xì)胞和胰島，分別在小鼠上下極同時(shí)移植胰島250個(gè)及與其體積胰腺外分泌細(xì)胞，成功建立40只胰島移植模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后腹腔注射生長抑素10ng/g，對照組術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)測定血糖水平及觀察生命體征的變化。術(shù)后5天摘除小鼠左腎移植物，采用冰凍切片TUNEL染色檢測胰腺外分泌細(xì)胞凋亡，免疫組化SP技

8、術(shù)測定移植物中的胰蛋白酶釋放量。
　　結(jié)果：①流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，胰島細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞凋亡率分別為(6.76±0.30)%和（6.21±0.40)%,兩組對較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；生長抑素實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞凋亡率分別為(21.34±0.34)%和（15.76±0.40)%,兩組對較，實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②原代培養(yǎng)后上清液中胰蛋白酶的含量ELISA測定：純化胰島組上清液中

9、胰蛋白酶濃度為（0.43±1.11）ng/ml，對照組為(5.03±1.20) ng/ml，后者明顯高于前者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;實(shí)驗(yàn)組上清液中胰蛋白酶濃度為（2.43±1.30）ng/ml，低于對照組，但高于純化胰島組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③原代培養(yǎng)后胰島素刺激指數(shù)的比較：純化胰島組胰島素刺激指數(shù)為3.85±1.20，對照組為1.55±1.12，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;實(shí)驗(yàn)組胰島

10、素釋放指數(shù)為2.53±1.10，低于純化胰島組，但高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；④胰腺外分泌細(xì)胞和胰島涂片的TUNEL結(jié)果分析：胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)：TUNEL結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（25.37±0.56）%，而對照組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（17.68±0.41）%，對照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；胰島細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑤細(xì)胞涂片免疫組化SP結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞呈棕褐色染色，實(shí)驗(yàn)

11、組P53染色陽性率為（10.65±0.45）%，對照組P53染色陽性率為（8.32±0.30）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑥術(shù)后5天冰凍切片的TUNEL凋亡檢測結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組小鼠的熒光著色的外分泌細(xì)胞明顯少于對照組。實(shí)驗(yàn)組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（18.35±0.45）%，而對照組胰腺外分泌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（10.23±0.23）%，對照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑦

12、術(shù)后5天胰蛋白酶免疫組化結(jié)果：對照組中胰島細(xì)胞周圍充斥有大量的深棕色的抗胰蛋白酶抗體陽性顆粒，而實(shí)驗(yàn)組中未見明顯的深棕色顯色。對照組陽性顆粒數(shù)為（80±4），實(shí)驗(yàn)組陽性顆粒數(shù)為（15±3），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴生長抑素可以誘導(dǎo)小鼠胰島移植過程中損傷的胰腺外分泌細(xì)胞凋亡，而對胰島細(xì)胞凋亡沒有影響。⑵生長抑素可以通過誘導(dǎo)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡，與凋亡調(diào)控基因P53的表達(dá)成正相關(guān)。⑶在胰島移植中應(yīng)用生長