β-arrestin1在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡及胰島素分泌中的作用及機制.pdf

1、縮膽囊素(chole cysto kinin，CCK)屬于胃腸激素，是進食引起的小腸黏膜(Ⅰ)細胞分泌的激素，在調(diào)節(jié)消化和代謝功能方面起著重要作用。已有研究證明，在胰島上，CCK通過作用于縮膽囊素受體(chole cysto kinin Areceptor，CCKAR)調(diào)節(jié)胰島素的分泌和胰島β細胞的數(shù)量，然而CCK作用于CCKAR后的下游信號通路并沒有明確的報道。胰腺β細胞膜上的CCKAR屬于G蛋白偶聯(lián)受體。本文我們表明，八肽縮膽囊素(

2、CCK-8s)激活CCKAR后誘導了三磷酸肌醇（inositol1，4，5-triphosphate，IP3）和腺苷-3'，5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）的積累，從而高效地促進了胰島素分泌。CCK-8s除了激活G蛋白信號傳導，也促進了CCKAR和β-arrestin1的復合物的形成。同時，利用siRNA沉默β-arrestin1后進行實驗研究，我們證實，β-arrestin1在CCK-8s促進胰島素分泌和防止胰腺β細胞凋亡的方面都起著重要

3、作用。β-arrestin1通過介導的胞內(nèi)長時相ERK的激活發(fā)揮抗凋亡作用，慢速時相激活的ERK激活p90RSK-phosphor-Bad抗凋亡途徑并且抑制caspase-3激活。β-arrestin1在CCKAR在胰腺β細胞中的下游的重要性可以為新的抗糖尿病藥物的開發(fā)提供方向。
　　[研究目的]
　　研究β-arrestin1在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡及胰島素分泌中的作用及機制。
　　[研究方法]
　　1.β-

4、arrestin1在縮膽囊素抗促進胰島素分泌中的作用及機制
　　(1)用Westernblot印跡分析技術(shù)檢查內(nèi)源性CCKAR和β-arrestin1的表達.
　　(2)ELISA檢測胰島素分泌的變化。
　　(3)ELISA檢測三磷酸肌醇的變化。
　　(4)ELISA檢測腺苷-3'，5'-環(huán)化一磷酸的變化。
　　2.β-arrestin1在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡中的作用及機制
　　(1)使用Hoec

5、hst33342染色和AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測高糖誘導的胰腺β細胞的凋亡。
　　(2)用Westernblot印跡分析技術(shù)檢測p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途徑的激活。
　　(3)SLIC方法構(gòu)建CCKAR到pcDNA3.1上，并在N端加flag標簽。
　　(4)免疫共沉淀法檢測在HEK293細胞中的β-arrestin1和CCKAR之間的相互作用。
　　(5)通過si

6、RNA轉(zhuǎn)染MIN6細胞沉默β-arrestin1的表達，研究β-arrestin1缺失后細胞信號轉(zhuǎn)導、功能的障礙。
　　[研究結(jié)果]
　　1.β-arrestin1在縮膽囊素抗促進胰島素分泌中的作用及機制
　　(1)我們首先證實了小鼠胰島β細胞中表達CCKAR。100pMCCK-8s處理小鼠離體胰島后，胰島素分泌增高4倍。而1μM選擇性CCKAR拮抗劑氯戊米特(Lorglumide)可以阻斷這種效應。同樣，100pMC

7、CK-8s處理分離的原代小鼠β胰島細胞也可以導致胰島素分泌增加約5倍，其效應也可以被Lorglumide阻斷。
　　(2)100pMCCK-8s誘導MIN6細胞的IP3的升高占卡巴膽堿誘導IP3的升高程度的40％，100pMCCK-8s誘導MIN6細胞的cAMP的升高程度占10nM的GLP-1誘導的cAMP的升高程度的60％。Gq蛋白的下游抑制劑U73122或者Gs蛋白下游PKA抑制劑H89分別抑制CCK-8s促進的胰島素分泌減少

8、至60％及50％，而同時使用兩種抑制劑，則完全抑制CCK-8s誘導MIN6細胞的胰島素分泌。
　　2.β-arrestin1在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡中的作用及機制
　　(1)高糖作用于MIN6細胞72小時后導致85％的細胞凋亡，當高糖與GLP-1共同作用于細胞時，細胞凋亡可降低到65％。同樣的，100pMCCK-8s與高糖同時刺激細胞是MIN6細胞的凋亡比例從85％減少到63％。
　　(2)CCK-8s導致了濃度依賴

9、性的ERK激活，100pM之后ERK的激活強度不再上升。1uMCCKAR拮抗劑Lorglumide預處理MIN6細胞后阻斷了CCK-8s引起的ERK激活。CCK-8s刺激MIN6細胞促進了兩個時期ERK1/2的激活，一個在刺激2分鐘時迅速達到高峰，另一個是在刺激后20分鐘時達到峰值，激活緩慢而持續(xù)?？焖倭姿峄腅RK1/2在細胞質(zhì)和細胞核中都存在，然而，慢速磷酸化的ERK1/2存在于細胞質(zhì)。
　　(3)CCK-8s刺激敲低β-ar

10、restin1的MIN6細胞，我們發(fā)現(xiàn)，快速時相激活的ERK下降了約30％，而慢速時相激活的ERK下降了90％。
　　(4)CCK-8s促進CCKAR和β-arrestin1之間的相互作用，在15分鐘達到最強，早于慢速時相ERK激活的時相。
　　(5)β-arrestin1敲低后顯著抑制CCK-8s誘導的p90RSK(Thr573)和Bad(Ser112)的磷酸化。CCK-8s抑制高糖誘導的caspase-3的切割。

11、　　(6)CCK-8s抑制高糖誘導的細胞凋亡，而這種作用在β-arrestin1敲低后被解除。
　　[結(jié)論]
　　CCK-8s促進胰腺β細胞分泌過程中，Gq信號通路和Gs信號通路均被激活，并且除了G蛋白信號通路參與胰島素分泌外，β-arrestin介導的信號通路也促進胰島素的分泌。
　　CCK-8s作用于CCKAR后可以促進ERK的磷酸化，從而進一步激活p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途徑，抑制了細胞色素C