吲哚乙酸-辣根過(guò)氧化物酶對(duì)人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma，SACC)來(lái)源于上皮，約占涎腺腫瘤的11％，在涎腺惡性腫瘤中占24％，男女發(fā)病率未見(jiàn)明顯差異性，好發(fā)年齡為40-60歲。SACC好發(fā)于小涎腺及大涎腺中較小的腺體，以腭腺、頜下腺和舌下腺多見(jiàn)，在腮腺腫瘤中僅占2％-3％。SACC對(duì)放化療均不敏感，其主要的治療方法仍然為手術(shù)治療，SACC侵襲性強(qiáng)，易沿神經(jīng)血管束向周?chē)M織擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，并可通過(guò)血運(yùn)轉(zhuǎn)移至肺、腦、骨

2、、肝等組織，術(shù)后復(fù)發(fā)率為16％-85％，轉(zhuǎn)移率為25％-55％，其中肺部轉(zhuǎn)移率則高達(dá)70％-100％，所以患者的預(yù)后較差，術(shù)后生存率較低。
　　口腔頜面部惡性腫瘤容易造成嚴(yán)重的面部畸形和口咽功能障礙，患者承受著心理和生理的莫大痛苦。目前的治療方法主要以外科手術(shù)為主，放射治療和化學(xué)藥物治療為其輔助治療手段，三種手段各有特點(diǎn)，互為補(bǔ)充，其地位均無(wú)法被取代。越來(lái)越多的研究將三種方法有效的結(jié)合起來(lái)，發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)，規(guī)避其缺點(diǎn)，最大程度的減

3、輕患者的痛苦，避免腫物的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移?；瘜W(xué)藥物療法因其特殊性而得到研究者的青睞，由原來(lái)的細(xì)胞毒性藥物的研究，逐步轉(zhuǎn)向研究新型的抗腫瘤藥物，以期在惡性腫瘤的治療中掀開(kāi)新的一頁(yè)。
　　植物激素是天然激素，也被稱為植物內(nèi)源激素，由植物自身代謝而產(chǎn)生。雖為簡(jiǎn)單的小分子有機(jī)化合物，但卻能發(fā)揮較為獨(dú)特的作用，在較低濃度下就能對(duì)植物及動(dòng)物產(chǎn)生明顯的影響。既往的研究主要集中在其對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響方面，后來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)某些植物激素對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)

4、育也會(huì)產(chǎn)生較為明顯的影響，所以逐步將植物激素引入到對(duì)腫瘤的治療上來(lái)。1942年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了吲哚乙酸(Indole-acetic-acid，IAA)的抗腫瘤作用，遂將其從高等植物中分離出來(lái)，逐步開(kāi)始了吲哚乙酸在惡性腫瘤領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。IAA是一種植物生長(zhǎng)激素，主要參與并調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的分裂、分化、生長(zhǎng)等過(guò)程。辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)含有激素，可以氧化吲哚乙酸，是特殊的植物過(guò)氧化物酶。關(guān)于吲哚乙

5、酸和辣根過(guò)氧化物的研究始于1995年，越來(lái)越多的研究表明，IAA在人體內(nèi)的耐受性較高，不易被哺乳類過(guò)氧化物酶氧化，只有在HRP存在時(shí)，IAA才會(huì)發(fā)生明顯的氧化，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，此代謝產(chǎn)物有毒性，但此毒性只對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用，對(duì)正常組織沒(méi)有危害。
　　本課題將從以下兩個(gè)部分通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究分別探討IAA/HRP對(duì)人腺樣囊性癌的作用，為腺樣囊性癌的防治提供新的思路。
　　第一部分:IAA/HRP對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

6、>　　目的:
　　建立人腮腺腺樣囊性癌系PACC-1561，同時(shí)采用人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-2細(xì)胞作為生物重復(fù)參考。通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖力、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡等檢測(cè)來(lái)觀察IAA/HRP對(duì)SACC-2細(xì)胞和PACC-1561細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　采用CCK-8法檢測(cè)指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化，按AnnexinⅤ--PE Apoptosis Kit操作手冊(cè)進(jìn)行早期細(xì)胞凋

7、亡的檢測(cè)，利用RT-PCR檢測(cè)核因子NF-κBp65mRNA在腺樣囊性癌細(xì)胞中的表達(dá)，蛋白兔疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中c-Myb蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　IAA/HRP抑制細(xì)胞增長(zhǎng)，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01);流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示IAA/HRP組細(xì)胞周期阻滯在G0-G1期;流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的AnnexinⅤ-PE水平，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率明顯升高;腺樣囊性癌細(xì)胞NF-κBp65mRNA在實(shí)驗(yàn)組中的

8、相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陽(yáng)性對(duì)照組5-Fu相比，未見(jiàn)明顯差異性;IAA/HRP作用于細(xì)胞后，上調(diào)抑癌基因Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)c-Myb蛋白的表達(dá)。
　　第二部分:IAA/HRP對(duì)裸鼠腺樣囊性癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　進(jìn)一步探討IAA/HRP對(duì)裸鼠腺樣囊性癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　方法:
　　建立腺樣囊性癌SACC-2和PACC-1561荷瘤裸鼠模

9、型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組8只:空白對(duì)照組、5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組和IAA/HRP實(shí)驗(yàn)組。第27天處死裸鼠后，稱重瘤體并計(jì)算抑瘤率，解剖裸鼠內(nèi)臟，采用HE染色，觀察藥物對(duì)各個(gè)臟器是否存在毒副作用;通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)各組腫瘤組織中Survivin蛋白的表達(dá)情況;實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　IAA/HRP組瘤重顯著低于生理鹽水組，與5Fu組無(wú)明顯差異;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后5Fu組裸鼠體重與

10、生理鹽水組裸鼠體重相比有顯著性差異，與IAA/HRP組裸鼠體重相比有顯著性差異，生理鹽水組與IAA/HRP組未見(jiàn)明顯差異;HE染色顯示IAA/HRP在短期內(nèi)應(yīng)用不會(huì)對(duì)裸鼠內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒副作用;蛋白免疫印跡法顯示Survivin條帶密度減小，與5-Fu表達(dá)相似;實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)MMP-2、MMP-9在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.IAA/HRP能有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，將細(xì)胞周期阻

11、滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞提早凋亡。并推測(cè)出抑制作用最強(qiáng)的時(shí)間為48h，有效抑制濃度為:60μmol/LIAA和1.2mg/LHRP。
　　2.IAA/HRP使NF-κBp65陽(yáng)性表達(dá)明顯下調(diào)，且與5-FU組沒(méi)有顯著差異;同時(shí)IAA/HRP可下調(diào)c-Myb蛋白的表達(dá)。
　　3.IAA/HRP對(duì)腺樣囊性癌荷瘤裸鼠有抑瘤作用，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng);IAA/HRP短期內(nèi)對(duì)腺樣囊性癌荷瘤裸鼠的體重及內(nèi)臟無(wú)明顯影響