吲哚乙酸聯(lián)合辣根過氧化物酶對人涎腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma SACC)是較為常見的涎腺惡性腫瘤之一,占涎腺腫瘤的10％、涎腺惡性腫瘤的22％以及頭頸部惡性腫瘤的1％,好發(fā)于小涎腺及大涎腺中較小的腺體,手術(shù)治療是其主要的治療方法。但其侵襲性較強(qiáng),易沿神經(jīng)血管束向周圍擴(kuò)散轉(zhuǎn)移,并可循血行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移到肺、肝、骨等組織,導(dǎo)致SACC患者術(shù)后生存率低,預(yù)后較差。因此尋找新的治療方法和有效抗癌藥物勢在

2、必行。
　　 植物激素在植物體內(nèi),作為執(zhí)行細(xì)胞通訊的化學(xué)信息在代謝、生長、形態(tài)形成等植物生理活動的各個(gè)方面均起著十分重要的作用。目前,有關(guān)植物激素抗腫瘤作用的研究取得了顯著成績。吲哚乙酸(indole-3-acetic,IAA)是一種植物生長激素,主要調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的分化、生長和分裂增殖。辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是一種亞鐵血紅素酶,能氧化包括IAA在內(nèi)的一系列底物。近年來的研究表明,I

3、AA的作用濃度取值不同,但HRP的濃度一定,IAA/HRP共同作用時(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長。并可誘導(dǎo)凋亡等作用,而當(dāng)IAA和HRP以二者聯(lián)合作用時(shí)的相同濃度單獨(dú)作用時(shí),則不會產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。鑒于不同細(xì)胞對其敏感性存在差異,本研究選擇人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83進(jìn)行實(shí)驗(yàn),觀察IAA/HRP對SACC-83細(xì)胞的作用,為了其治療SACC提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 本研究擬采用經(jīng)不同濃度的IAA/HRP處理過的

4、SACC-83細(xì)胞株進(jìn)行檢測,觀察其對SACC-83細(xì)胞的生長抑制、細(xì)胞周期改變、抑癌基因及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響,驗(yàn)證IAA/HRP對SACC-83細(xì)胞的抑制作用,分析IAA/HRP抗腫瘤作用的可能機(jī)制；為IAA/HRP應(yīng)用于SACC的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1 SACC-83細(xì)胞株由北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院惠贈。
　　 2 IAA和HRP購自Sigma公司。
　　 3光鏡觀察IAA

5、/HRP作用于SACC-83細(xì)胞后細(xì)胞的生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。
　　 4采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率:實(shí)驗(yàn)分組(設(shè)調(diào)零組、對照組和實(shí)驗(yàn)組),調(diào)零組只加培養(yǎng)基,對照組加細(xì)胞和培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組按照IAA的濃度分別為20、40、60、80、100μmol/L五組,每組HRP的濃度均為1.2mg/L。測其作用于SACC-83細(xì)胞24h、48h、72h、96h后的OD值,并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率。
　　 5采用流式細(xì)胞

6、儀檢測細(xì)胞周期的改變。
　　 6采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blot檢測IAA/HRP對SACC-83細(xì)胞抑癌相關(guān)基因PTEN蛋白表達(dá)的改變。
　　 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)分析凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Livina基因mRNA表達(dá)水平的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1細(xì)胞形態(tài)對照組細(xì)胞生長較快,呈多邊形,排列成鋪路石狀。60μmol/LIAA與1.2mg/LHRP

7、組作用SACC-83細(xì)胞48后,細(xì)胞邊緣收縮,梭形細(xì)胞增多,核漿比例下降,核仁變?。辉囼?yàn)組中100μmol/LIAA與1.2mg/LHRP組作用SACC-83細(xì)胞48后細(xì)胞的形態(tài)變化更加明顯,并有部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,變小變圓,空泡明顯。
　　 2 IAA/HRP對SACC-83細(xì)胞增殖的影響與對照組相比,除20μmol/L組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,40μmol/L濃度以上的IAA與HRP結(jié)合均可抑制SACC-83細(xì)胞的增殖,隨著濃度的增加

8、,細(xì)胞增殖能力下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著時(shí)間的延長,其增殖能力也下降,其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明IAA/HRP對SACC-83的抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。
　　 3細(xì)胞周期分析與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組(60、100μmol/LIAA+1.2mg/LHRP)作用48h時(shí),隨著IAA藥物濃度的增大,流式細(xì)胞儀檢測示G0/G1期細(xì)胞百分比呈上升趨勢,S期和G2/M期細(xì)胞百分比均呈下降趨勢,其差別均具

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果分析濃度為60μmol/L和100μmol/L組實(shí)驗(yàn)組的測量值均存在顯著差異(P<0.04),隨著IAA濃度的增加,PTEN的值增高明顯,說明IAA/HRP對SACC-83細(xì)胞的抑制具有濃度依賴性。
　　 5 Western blot檢測抑癌基因的表達(dá)100μmol/LIAA組在作用SACC-83細(xì)胞48h后,PTEN蛋白條帶增寬、含量明顯上升。
　　 6實(shí)

10、時(shí)熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)不同濃度的IAA/HRP(60、100μmol/LIAA+1.2mg/LHRP)聯(lián)合作用可上調(diào)Caspase-3的mRNA表達(dá)(P<0.05),下調(diào)Livinα的mRNA的表達(dá)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 IAA/HRP體外對SACC-83細(xì)胞具有增殖抑制作用,且呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 2 IAA/HRP可引起SACC-83細(xì)胞周期阻滯,G0/G1期比值逐漸

11、增加,S期和G2/M期的比值逐漸降低,且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 3 IAA/HRP對SACC-83細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,可通過上調(diào)抑癌基因PTEN蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
　　 4 IAA/HRP可誘導(dǎo)人腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Livina的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　 5細(xì)胞周期阻滯、調(diào)控凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Livina及抑癌基因PTEN的