續(xù)斷總皂苷治療骨關(guān)節(jié)炎及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:采用HULTH造模方法構(gòu)建新西蘭大白兔骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，續(xù)斷總皂苷進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而觀察軟骨組織形態(tài)、病理變化及炎癥因子表達(dá)，同時(shí)利用續(xù)斷總皂苷在體外干預(yù)軟骨細(xì)胞凋亡與增殖及其相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，從而了解續(xù)斷總皂苷在治療骨關(guān)節(jié)炎模型的作用機(jī)制。
　　方法:取28只新西蘭大白兔，分別每組設(shè)立7只，隨后隨機(jī)分為4組:分別是正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（美洛昔康）、治療組。利用構(gòu)建新西蘭大白兔骨關(guān)節(jié)炎模型，然后在模型成功后1周對(duì)新西蘭大白

2、兔連續(xù)給藥6周，再對(duì)新西蘭大白兔骨關(guān)節(jié)炎的病理及相關(guān)炎性細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。(1)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的軟骨組織進(jìn)行收集，并且進(jìn)行制作切片，然后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)及軟骨組織病理的變化。(2)收集關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液或者關(guān)節(jié)囊，然后采用ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中TNF-α，IL-1β，PGE2和IL-6的含量。(3)利用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3和MMP-1的蛋白表達(dá)含量。
　　(1)通過(guò)利用續(xù)斷總皂苷從而達(dá)到促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)

3、的實(shí)驗(yàn)研究:利用新西蘭大白兔軟骨進(jìn)行消化，從而獲得軟骨細(xì)胞，得到的軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，利用第3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然后利用顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)，利用免疫組化鑒定軟骨細(xì)胞及分化能力。實(shí)驗(yàn)可以分為:高劑量組(續(xù)斷總皂苷終濃度為100ug/L)、中劑量組（續(xù)斷總皂苷終濃度為50ug/L）、低劑量組（續(xù)斷總皂苷終濃度為25ug/L）、對(duì)照組（續(xù)斷總皂苷終濃度為0ug/L）。在作用72h后，然后利用MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，了解各組軟骨細(xì)胞

4、周期的分布。Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞中p21、CDK4、cyclinD1蛋白的表達(dá)。
　　(2)通過(guò)利用續(xù)斷總皂苷從而抑制軟骨細(xì)胞調(diào)亡的實(shí)驗(yàn)研究:利用第3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為:對(duì)照組、不加藥的模型組、低劑量、中劑量、高劑量，其中對(duì)照組加含10％胎牛血清的的DMEM培養(yǎng)基，其余各組均加入含有1mmol/L SNP的10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。Western-Blot檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、Bax、

5、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)。Realtime PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9MRNA表達(dá)。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2含量。
　　結(jié)果:1、通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知:正常組可以看到軟骨組織表面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻。而模型組軟骨組織則受到一定的破壞;治療組軟骨表面裂隙較少，軟骨組織損傷有所減輕。ElISA檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中TNF-α，I

6、L-6，PGE2和IL-1β的含量結(jié)果表明:與正常組相比，模型組關(guān)節(jié)滑液中TNF-α，IL-6，PGE2和IL-1β表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）;與模型組相比，治療組關(guān)節(jié)滑液中TNF-α，IL-6，PGE2和IL-1β表達(dá)量明顯降低。Western-blot結(jié)果表明:與正常組相比，模型組中MMP-3、MMP-1蛋白含量顯著提高(P＜0.01);與模型組相比，治療組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-1蛋白含量顯著降低(P＜0.01)。

7、>　　2、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究:
　　軟骨細(xì)胞鑒定:細(xì)胞染成藍(lán)紫色，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核染成紫紅色的，根據(jù)流式鑒定結(jié)果該細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征。軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:軟骨細(xì)胞在誘導(dǎo)14天后，細(xì)胞就會(huì)呈現(xiàn)出向成骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)呈梭狀生長(zhǎng)，并且會(huì)出現(xiàn)重疊排列，通過(guò)茜素紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出朱紅色，有鈣化灶結(jié)節(jié)出現(xiàn)。
　　利用續(xù)斷總皂苷從而會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的研究:
　　結(jié)果表明，利用續(xù)斷

8、總皂苷后能夠顯著的促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性。
　　細(xì)胞周期分布及細(xì)胞周期蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比，中、高劑量組的G0/G1期明顯降低(P＜0.01)，G2/M期則則會(huì)出現(xiàn)明顯升高的情況(P＜0.05)。在通過(guò)干預(yù)72h后，與模型組相比，高、中劑量組的CDK4和CyclinD1蛋白的表達(dá)會(huì)顯著升高(P＜0.05);與對(duì)照組相比，中、高劑量組中p21的蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　續(xù)斷總皂苷抑制軟骨細(xì)胞凋

9、亡的研究:
　　與模型組相比，低、中、高劑量組中Bax蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.05);Bcl2蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，且NF-κB表達(dá)同樣有該特點(diǎn)，中、高劑量表達(dá)低于模型組(P＜0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量的Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下降;Realtime PCR結(jié)果表明，低、中、高劑量組中Caspase-3、Caspase-9mRNA表達(dá)量明顯低于模型組。與模型組比，低、中、高劑量

10、組的IL-1β，IL-6，PGE2和TNF-α表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、續(xù)斷總皂苷可以延緩OA模型中軟骨組織退變，與IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2分泌，降低MMP-1及MMP-3表達(dá)有關(guān)。
　　2、續(xù)斷總皂苷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，且是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CDK4表達(dá)，而抑制p21表達(dá)，并縮短細(xì)胞周期G0/G1期實(shí)現(xiàn)的。
　　3、續(xù)斷總皂苷能抑制SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋