乳腺癌的分子分型與超聲征象的相關性及PADI2參與乳腺癌發(fā)病的研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 乳腺癌分子分型與超聲征象相關性的研究
　　目的:
　　依據(jù)新的分型標準對乳腺癌進行分子分型，研究乳腺癌的分子分型與超聲征象的相關性。
　　方法:
　　收集288例在山東省千佛山醫(yī)院經(jīng)手術病理證實的乳腺癌患者，根據(jù)其ER、PR、HER2及Ki67的免疫組織化學結果分為六型: LA型、LB(HER2-，PR+,Ki67≥14％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki

2、67)型、LB-HER2+型、HER2+型、三陰性型?；仡櫺苑治雒课换颊叩某晥D像，包括腫塊大小(＜2cm/≥2cm)、形狀（圓形或橢圓形/不規(guī)則形）、方位（平行/垂直）、邊緣（光整/模糊/成角/微小分葉/毛刺狀）、周圍高回聲暈（無/有）、后方回聲特征（無變化/增強/衰減/混合性改變）、微鈣化（無/有）、Alder血流半定量分級（＜Ⅱ級/≥Ⅱ級）、淋巴結轉移（無/有），比較各型乳腺癌之間不同超聲征象出現(xiàn)率的差異。計量資料采用單因素方差分

3、析統(tǒng)計，計數(shù)資料采用卡方檢驗及Fisher確切概率法統(tǒng)計，檢驗水準P＜0.05。
　　結果:
　　各分型乳腺癌患者的年齡無統(tǒng)計學差異。LA型和LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型Ki67≥14％的比例分別為0和100％，此兩組不參與Ki67的統(tǒng)計。LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、LB-HER2+型、HER2+型及三陰性乳腺癌Ki67≥14％的比例分別為38.4％、65％、84％、78.6％，四組之間相比

4、差異有統(tǒng)計學意義。超聲圖像分析發(fā)現(xiàn)各分子類型乳腺癌在腫塊大小、形狀、邊緣、周邊高回聲暈、后方回聲特征、微鈣化和淋巴結轉移方面差異有統(tǒng)計學意義，在腫塊方位及Alder血流分級方面差異沒有統(tǒng)計學意義。組內差異具體描述如下:
　　(1)在腫塊大小方面，LA型腫塊大小≥2cm的比例最低，與其它各型之間相比差異均有統(tǒng)計學意義。
　　(2)在腫塊形狀方面，三陰性乳腺癌表現(xiàn)為圓形或橢圓形的比例最高，與LB(HER2-，PR+，Ki67≥1

5、4％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、LB-HER2+型相比分別有統(tǒng)計學差異。
　　(3)在邊緣特征方面，HER2+型乳腺癌邊緣毛刺征的出現(xiàn)率最低，與LA型、LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB-HER2+型相比均有統(tǒng)計學意義。
　　(4)周邊高回聲暈在HER2+型和三陰性乳腺癌的存在率較低。周邊高回聲暈的存在率在LA型、LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型與HER2+型之間及LB(

6、HER2-，PR+，Ki67≥14％)與三陰性乳腺癌之間分別有統(tǒng)計學差異。
　　(5)在后方回聲特征方面，LA型與LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、HER2+型之間分別有統(tǒng)計學差異，LA型后方回聲衰減的比例高于其他型，LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型和HER2+型后方回聲增強的比例高于LA型;三陰性乳腺癌后方回聲增強

7、的比例最高，與其余型乳腺癌之間相比均有統(tǒng)計學差異。
　　(6)在微鈣化方面，三陰性乳腺癌微鈣化的出現(xiàn)率最低，與LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB-HER2+型、HER2+型之間分別有統(tǒng)計學差異。HER2+型微鈣化的出現(xiàn)率最高，與LA型及LB（HER2-，PR-，任何Ki67）相比有統(tǒng)計學意義。
　　(7)在淋巴結轉移方面，LA型淋巴結轉移的比例最低，與LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、LB-HER

8、2+型、三陰性乳腺癌之間有統(tǒng)計學差異;LB(HER2-，PR-，任何Ki67)淋巴結轉移的比例最高，與LA型及LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型相比有統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　1.乳腺癌的分子分型與超聲征象存在相關性。
　　2.Ki67表達水平與乳腺癌的大小及后方回聲增強相關。PR陰性與后方回聲增強及淋巴結轉移相關。Ki67水平和PR陰性分別對乳腺癌的超聲征象有獨立的影響。
　　第二部分 PADI

9、2參與乳腺癌發(fā)病的研究
　　目的:
　　研究PADI2的SNP與腫瘤發(fā)病風險的相關性;PADI2對乳腺癌細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響;PCR array深入研究PADI2在乳腺癌發(fā)生中的作用機制。
　　方法:
　　1.PADI2的SNP與腫瘤發(fā)病風險的相關性
　　實驗采用SequenomMassARRAY基因型分析法和TaqMan探針基因型分析法。實驗所用樣本均來源于齊魯石化總醫(yī)院（中國，山東，淄博）臨床

10、實驗室，實驗對象分為2組:病例組為經(jīng)病理檢查證實的惡性腫瘤患者;對照組為來自健康查體科的健康人群。所需樣本為采集外周靜脈全血2ml。利用Haploview4.2軟件，通過搜索HapMap數(shù)據(jù)庫尋找PADI2基因座的Tag SNPs。在PADI2的基因編碼區(qū)找到了4個Tag SNPs，包括rs2746533、rs79395834、rs2076616和rs10788656。隨后用SequenomMassARRAY基因型分析方法檢測以上4個T

11、agSNPs在病例組和對照組的等位基因頻率和基因型頻率。SequenomMassARRAY基因型分析的步驟包括:提取樣本DNA、PCR擴增反應、PCR產物的堿性磷酸酶處理、單堿基延伸反應、樹脂純化、芯片點樣、質譜檢測等。SequenomMassARRAY基因型分析方法結果顯示rs10788656位點的等位基因頻率和基因型頻率與多種腫瘤發(fā)病的相關性最強。隨后我們在新的樣本用TaqMan探針基因型分析法對rs10788656位點與多種腫瘤發(fā)

12、病風險的相關性進行了驗證。步驟包括提取用于TaqMan基因型分析的樣本DNA，在96孔板中加入正向引物、反向引物、SNP分型探針及Master Mix試劑，進行PCR反應，應用在線軟件分析結果。
　　2.PADI2對乳腺癌細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響
　　培養(yǎng)MCF7細胞，加入抗PADI2 siRNA抑制PADI2表達，熒光定量PCR檢測抑制效率，確定抑制效率在4倍以上，分別用CCK-8細胞增殖實驗、流式細胞技術、Tran

13、swell小室遷移實驗檢測抑制PADI2表達對乳腺癌細胞增殖、測亡和遷移能力的影響。
　　3.PCR array研究PADI2在乳腺癌發(fā)生中的作用機制
　　培養(yǎng)MCF7乳腺癌細胞，加入抗PADI2 siRNA抑制其PADI2的表達，同時設立陰性對照組和空白對照組。48h后熒光定量PCR檢測抑制效率。將抑制效率在4倍以上的cDNA用于the Cancer PathwayFinder PCR array和SignalTransd

14、uction Pathway PCR array分析。檢出與陰性對照組相比表達改變在4倍以上的基因。合成檢出基因的引物，用熒光定量PCR驗證PCR array檢出結果。
　　結果:
　　1.SequenomMassARRAY基因型分析結果顯示PADI2基因的rs10788656位點在如下各組與對照組之間的SNP差異有統(tǒng)計學意義:乳腺癌患者和對照組之間的基因型頻率、宮頸癌患者和對照組的等位基因頻率、食管癌患者和對照組之間的等位

15、基因頻率和基因型頻率、肺癌患者與對照組之間的等位基因頻率、直腸癌患者和對照組之間的基因型頻率。rs2746533位點的等位基因頻率和基因型頻率在胃癌患者和對照組之間有明顯差異。rs2076616位點的基因型頻率在胃癌患者和對照組之間有明顯差異。rs79395834位點在所檢測病例中沒有明顯的SNP差異。
　　TaqMan探針基因型分析法顯示rs10788656位點在乳腺癌患者與對照組之間的等位基因頻率和基因型頻率存在差異?；蛐头?/p>

16、析沒有檢測出rs10788656在結腸癌、宮頸癌、食管癌、胃癌、肝癌和直腸癌患者和對照組之間的差異。
　　2.用抗PADI2 siRNA抑制MCF7的PADI2表達后，乳腺癌細胞遷移能力明顯下降，細胞的增殖和凋亡沒有明顯變化。
　　3.熒光定量PCR結果顯示經(jīng)抗PADI2 siRNA處理后，PADI2 mRNA表達明顯被抑制。The Cancer Pathwayfinder PCR array檢測出9個基因的表達發(fā)生明顯變化

17、，包括ACSL4，BIRC3，CA9，CCL2，F(xiàn)LT1，F(xiàn)OXC2，G6PD，IGFBP3和SNAI2。The Signal Transduction PCR array檢測出16個基因的表達發(fā)生明顯變化，包括CA9, HEY2, ACSL4, ACSL5, BCL2A1, BIRC3, CEBPD, CSF1, FABP1,FOSL1，HES5，ICAM1，TNF，WNT3A和WNT6。通過熒光定量PCR對PCRarray檢出結果進