乳腺癌的分子分型與超聲征象的相關(guān)性及PADI2參與乳腺癌發(fā)病的研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 乳腺癌分子分型與超聲征象相關(guān)性的研究
　　目的:
　　依據(jù)新的分型標(biāo)準(zhǔn)對乳腺癌進(jìn)行分子分型，研究乳腺癌的分子分型與超聲征象的相關(guān)性。
　　方法:
　　收集288例在山東省千佛山醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的乳腺癌患者，根據(jù)其ER、PR、HER2及Ki67的免疫組織化學(xué)結(jié)果分為六型: LA型、LB(HER2-，PR+,Ki67≥14％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki

2、67)型、LB-HER2+型、HER2+型、三陰性型。回顧性分析每位患者的超聲圖像，包括腫塊大小(＜2cm/≥2cm)、形狀（圓形或橢圓形/不規(guī)則形）、方位（平行/垂直）、邊緣（光整/模糊/成角/微小分葉/毛刺狀）、周圍高回聲暈（無/有）、后方回聲特征（無變化/增強(qiáng)/衰減/混合性改變）、微鈣化（無/有）、Alder血流半定量分級（＜Ⅱ級/≥Ⅱ級）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無/有），比較各型乳腺癌之間不同超聲征象出現(xiàn)率的差異。計量資料采用單因素方差分

3、析統(tǒng)計，計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)及Fisher確切概率法統(tǒng)計，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05。
　　結(jié)果:
　　各分型乳腺癌患者的年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。LA型和LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型Ki67≥14％的比例分別為0和100％，此兩組不參與Ki67的統(tǒng)計。LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、LB-HER2+型、HER2+型及三陰性乳腺癌Ki67≥14％的比例分別為38.4％、65％、84％、78.6％，四組之間相比

4、差異有統(tǒng)計學(xué)意義。超聲圖像分析發(fā)現(xiàn)各分子類型乳腺癌在腫塊大小、形狀、邊緣、周邊高回聲暈、后方回聲特征、微鈣化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在腫塊方位及Alder血流分級方面差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。組內(nèi)差異具體描述如下:
　　(1)在腫塊大小方面，LA型腫塊大小≥2cm的比例最低，與其它各型之間相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)在腫塊形狀方面，三陰性乳腺癌表現(xiàn)為圓形或橢圓形的比例最高，與LB(HER2-，PR+，Ki67≥1

5、4％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、LB-HER2+型相比分別有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(3)在邊緣特征方面，HER2+型乳腺癌邊緣毛刺征的出現(xiàn)率最低，與LA型、LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB-HER2+型相比均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4)周邊高回聲暈在HER2+型和三陰性乳腺癌的存在率較低。周邊高回聲暈的存在率在LA型、LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型與HER2+型之間及LB(

6、HER2-，PR+，Ki67≥14％)與三陰性乳腺癌之間分別有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(5)在后方回聲特征方面，LA型與LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、HER2+型之間分別有統(tǒng)計學(xué)差異，LA型后方回聲衰減的比例高于其他型，LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型和HER2+型后方回聲增強(qiáng)的比例高于LA型;三陰性乳腺癌后方回聲增強(qiáng)

7、的比例最高，與其余型乳腺癌之間相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(6)在微鈣化方面，三陰性乳腺癌微鈣化的出現(xiàn)率最低，與LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型、LB-HER2+型、HER2+型之間分別有統(tǒng)計學(xué)差異。HER2+型微鈣化的出現(xiàn)率最高，與LA型及LB（HER2-，PR-，任何Ki67）相比有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(7)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，LA型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例最低，與LB(HER2-，PR-，任何Ki67)型、LB-HER

8、2+型、三陰性乳腺癌之間有統(tǒng)計學(xué)差異;LB(HER2-，PR-，任何Ki67)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例最高，與LA型及LB(HER2-，PR+，Ki67≥14％)型相比有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.乳腺癌的分子分型與超聲征象存在相關(guān)性。
　　2.Ki67表達(dá)水平與乳腺癌的大小及后方回聲增強(qiáng)相關(guān)。PR陰性與后方回聲增強(qiáng)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Ki67水平和PR陰性分別對乳腺癌的超聲征象有獨(dú)立的影響。
　　第二部分 PADI

9、2參與乳腺癌發(fā)病的研究
　　目的:
　　研究PADI2的SNP與腫瘤發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性;PADI2對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響;PCR array深入研究PADI2在乳腺癌發(fā)生中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.PADI2的SNP與腫瘤發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性
　　實(shí)驗(yàn)采用SequenomMassARRAY基因型分析法和TaqMan探針基因型分析法。實(shí)驗(yàn)所用樣本均來源于齊魯石化總醫(yī)院（中國，山東，淄博）臨床

10、實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)對象分為2組:病例組為經(jīng)病理檢查證實(shí)的惡性腫瘤患者;對照組為來自健康查體科的健康人群。所需樣本為采集外周靜脈全血2ml。利用Haploview4.2軟件，通過搜索HapMap數(shù)據(jù)庫尋找PADI2基因座的Tag SNPs。在PADI2的基因編碼區(qū)找到了4個Tag SNPs，包括rs2746533、rs79395834、rs2076616和rs10788656。隨后用SequenomMassARRAY基因型分析方法檢測以上4個T

11、agSNPs在病例組和對照組的等位基因頻率和基因型頻率。SequenomMassARRAY基因型分析的步驟包括:提取樣本DNA、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、PCR產(chǎn)物的堿性磷酸酶處理、單堿基延伸反應(yīng)、樹脂純化、芯片點(diǎn)樣、質(zhì)譜檢測等。SequenomMassARRAY基因型分析方法結(jié)果顯示rs10788656位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率與多種腫瘤發(fā)病的相關(guān)性最強(qiáng)。隨后我們在新的樣本用TaqMan探針基因型分析法對rs10788656位點(diǎn)與多種腫瘤發(fā)

12、病風(fēng)險的相關(guān)性進(jìn)行了驗(yàn)證。步驟包括提取用于TaqMan基因型分析的樣本DNA，在96孔板中加入正向引物、反向引物、SNP分型探針及Master Mix試劑，進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)用在線軟件分析結(jié)果。
　　2.PADI2對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響
　　培養(yǎng)MCF7細(xì)胞，加入抗PADI2 siRNA抑制PADI2表達(dá)，熒光定量PCR檢測抑制效率，確定抑制效率在4倍以上，分別用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、Tran

13、swell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測抑制PADI2表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖、測亡和遷移能力的影響。
　　3.PCR array研究PADI2在乳腺癌發(fā)生中的作用機(jī)制
　　培養(yǎng)MCF7乳腺癌細(xì)胞，加入抗PADI2 siRNA抑制其PADI2的表達(dá)，同時設(shè)立陰性對照組和空白對照組。48h后熒光定量PCR檢測抑制效率。將抑制效率在4倍以上的cDNA用于the Cancer PathwayFinder PCR array和SignalTransd

14、uction Pathway PCR array分析。檢出與陰性對照組相比表達(dá)改變在4倍以上的基因。合成檢出基因的引物，用熒光定量PCR驗(yàn)證PCR array檢出結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.SequenomMassARRAY基因型分析結(jié)果顯示PADI2基因的rs10788656位點(diǎn)在如下各組與對照組之間的SNP差異有統(tǒng)計學(xué)意義:乳腺癌患者和對照組之間的基因型頻率、宮頸癌患者和對照組的等位基因頻率、食管癌患者和對照組之間的等位

15、基因頻率和基因型頻率、肺癌患者與對照組之間的等位基因頻率、直腸癌患者和對照組之間的基因型頻率。rs2746533位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在胃癌患者和對照組之間有明顯差異。rs2076616位點(diǎn)的基因型頻率在胃癌患者和對照組之間有明顯差異。rs79395834位點(diǎn)在所檢測病例中沒有明顯的SNP差異。
　　TaqMan探針基因型分析法顯示rs10788656位點(diǎn)在乳腺癌患者與對照組之間的等位基因頻率和基因型頻率存在差異?；蛐头?/p>

16、析沒有檢測出rs10788656在結(jié)腸癌、宮頸癌、食管癌、胃癌、肝癌和直腸癌患者和對照組之間的差異。
　　2.用抗PADI2 siRNA抑制MCF7的PADI2表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞遷移能力明顯下降，細(xì)胞的增殖和凋亡沒有明顯變化。
　　3.熒光定量PCR結(jié)果顯示經(jīng)抗PADI2 siRNA處理后，PADI2 mRNA表達(dá)明顯被抑制。The Cancer Pathwayfinder PCR array檢測出9個基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化

17、，包括ACSL4，BIRC3，CA9，CCL2，F(xiàn)LT1，F(xiàn)OXC2，G6PD，IGFBP3和SNAI2。The Signal Transduction PCR array檢測出16個基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化，包括CA9, HEY2, ACSL4, ACSL5, BCL2A1, BIRC3, CEBPD, CSF1, FABP1,FOSL1，HES5，ICAM1，TNF，WNT3A和WNT6。通過熒光定量PCR對PCRarray檢出結(jié)果進(jìn)