新型抗抑郁藥物調(diào)節(jié)小鼠皮層神經(jīng)元鉀通道的新機制.pdf

1、抑郁癥(depression)是一種常見的心境障礙，可由各種原因引起，臨床表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性低下，同時伴有顯著而持久的心境低落，且心境低落與其處境不相稱，嚴(yán)重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為?？挂钟羲?antidepressant)是眾多精神藥物的一個大類，主要用于治療抑郁癥和各種抑郁狀態(tài)。新型抗抑郁藥物是從80年代后開始陸續(xù)研發(fā)出的第二代抗抑郁藥物，此類抗抑郁藥物療效比第一代抗抑郁藥物顯著，同時具有抗膽堿能作用弱、對心血管系統(tǒng)影響小等特點

2、，因此被稱為是一類安全性較高的抗抑郁藥物。
　　目前對于新型抗抑郁藥物的報道主要集中在研究它們對心血管調(diào)節(jié)的藥理功能，也有文獻報道抗抑郁藥物對動物行為的調(diào)節(jié)作用和對中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝調(diào)節(jié)等現(xiàn)象。而關(guān)于新型抗抑郁藥物對中樞神經(jīng)元細(xì)胞膜離子通道調(diào)節(jié)的報道非常少，目前為止還沒有文獻對新型抗抑郁藥物調(diào)節(jié)神經(jīng)元鉀通道的細(xì)胞分子機制進行相關(guān)報道，更沒有文獻提供抑郁癥治療和神經(jīng)元細(xì)胞膜鉀通道之間聯(lián)系的直接證據(jù)。本文以小鼠皮層神經(jīng)元鉀離子通道為主要

3、研究對象，使用全細(xì)胞膜片鉗記錄、大腦切片電生理記錄、免疫組化、免疫印記蛋白定量測試以及分子克隆技術(shù)等方法，研究探索新型抗抑郁藥物阿莫沙平(amoxapine，AXP)和潛在抗抑郁藥噻庚啶(cyproheptadine，CPH)調(diào)節(jié)小鼠皮層神經(jīng)元外向延遲整流型鉀電流（IK）的分子細(xì)胞機制，為臨床上以鉀通道為藥物靶點來開發(fā)療效更好、副作用更少的抗抑郁藥提供實驗思路和理論依據(jù)。本文的研究結(jié)果表明，新型抗抑郁藥物在調(diào)節(jié)小鼠皮層神經(jīng)元鉀通道時，存

4、在由G蛋白受體耦聯(lián)的第二信使調(diào)節(jié)下游信號通路的間接調(diào)控新機制。研究主要分為以下三個部分:
　　第一部分:我們以離體培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元為細(xì)胞模型，研究了新型抗抑郁藥阿莫沙平對小鼠皮層神經(jīng)元外向延遲整流型鉀電流(IK)的調(diào)節(jié)機制。通過全細(xì)胞膜片鉗記錄，我們發(fā)現(xiàn)AXP可顯著抑制離體培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上TEA敏感的IK;在濃度為10μM～500μM范圍內(nèi)，這種抑制作用具有濃度依賴性。同時，在100μM濃度的AXP的作用下，IK的半激活電位

5、和半失活電位均向超級化方向偏移。此外，應(yīng)用PKA信號通路激動劑forskolin和db-cAMP均可以模擬AXP對皮層神經(jīng)元IK的抑制作用，并且PKA信號通路阻斷劑H-89可以顯著消除AXP的抑制作用。免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA測定結(jié)果表明，AXP孵育后的皮層神經(jīng)元胞內(nèi)cAMP的濃度顯著升高。這些結(jié)果說明AXP可能通過cAMP/PKA信號通路來調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元IK。進一步的研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的5-羥色胺(5-HT)Ⅱ型受體抑制劑和G蛋白Gs亞

6、基的阻斷劑均可以抑制AXP介導(dǎo)的皮層神經(jīng)元IK下降，提示我們AXP可能通過5-HT受體來增強胞內(nèi)cAMP/PKA信號通路，進而調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元電壓門控鉀離子通道的磷酸化位點。最后利用Kv2.1-α亞單位的特異性阻斷劑JZTX-Ⅲ和在 HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染小鼠Kv2.1-α亞單位的電生理結(jié)果表明，AXP抑制皮層神經(jīng)元IK作用的靶位點是皮層神經(jīng)元Kv2.1-α亞單位。這些結(jié)果提示我們新型抗抑郁藥物阿莫沙平可以通過胞內(nèi)信號途徑間接地調(diào)節(jié)鉀通道

7、，而不是此前很多文獻報道的對鉀通道直接的抑制，為我們下一步深入了解其他類型抗抑郁藥對鉀通道調(diào)節(jié)帶來新的思考空間，同時也可以為臨床上篩選抗抑郁藥提供參考。
　　第二部分:這部分結(jié)果是在完成AXP通過胞內(nèi)信號途徑調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元鉀通道的基礎(chǔ)上進行的，目的在于進一步探討其他抗抑郁藥調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元鉀通道的潛在分子機制，同時尋找以電壓門控鉀離子通道為藥物靶點，治療抑郁癥的新方法。我們的體外配體和受體結(jié)合實驗研究結(jié)果首次證明，另一個潛在的抗抑郁

8、藥噻庚啶可以作為sigma-1受體的配體，通過激活sigma-1受體耦聯(lián)的μ型阿片肽受體抑制皮層神經(jīng)元胞內(nèi)的PKA信號通路，進而去磷酸化皮層神經(jīng)元電壓門控鉀離子通道，增加外向鉀電流。通過離體培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗記錄，我們發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)給予不同濃度的CPH可顯著增強離體培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上TEA敏感的IK;在濃度為20nM～20μM范圍內(nèi)，這種增強作用具有濃度依賴性。Western blot測定神經(jīng)元胞內(nèi)pPKA含量結(jié)果表明，CPH孵育后

9、的神經(jīng)元胞內(nèi)pPKA含量較未孵育的對照組有顯著下降。與AXP調(diào)節(jié)IK機制類似，我們同時也證明cAMP/PKA信號通路在調(diào)節(jié)鉀通道方面的作用機制可以通過去磷酸化Kv2.1-α亞單位來增強皮層神經(jīng)元IK。這提示我們CPH將會顯著改變神經(jīng)元靜息膜電位，同時影響皮層神經(jīng)元細(xì)胞膜的興奮性，為進一步研究藥物提高神經(jīng)元興奮性進而增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮奠定了細(xì)胞分子方面的基礎(chǔ)。
　　第三部分:有了前面兩部分結(jié)果之后，我們將目光轉(zhuǎn)向腦組織切片和整體

10、動物的研究上來。研究目的在于驗證CPH是否可以改變神經(jīng)元的興奮性。對小鼠前額葉皮層的腦切片全細(xì)胞膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，CPH顯著改變錐體神經(jīng)元誘發(fā)動作電位的頻率，同時也使得神經(jīng)元靜息膜電位顯著朝去極化方向改變。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是CPH通過sigma-1受體改變了PKA下游的磷酸酶活性，去磷酸化內(nèi)向整流鉀通道造成的。活體動物行為學(xué)實驗表明，CPH可以顯著增強小鼠在自發(fā)活動行為中的運動路程，這個效果與咖啡因造成的小鼠多動現(xiàn)象類似，提示我們C