芝麻素的神經(jīng)保護(hù)和抗焦慮作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　芝麻素作為一種主要的木脂素廣泛存在于芝麻籽和芝麻油中。文獻(xiàn)報道其不僅具有抗高血壓、降低膽固醇、防止氧化應(yīng)激損傷等多種藥理作用，還具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用。然而，芝麻素對 NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用以及對慢性痛引起的焦慮作用研究較少，本研究旨在評價芝麻素對 NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，同時探索芝麻素對慢性炎性痛引起小鼠焦慮作用的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1. MC

2、AO模型的建立
　　制備大腦中動脈栓塞（MCAO）腦缺血再灌注損傷小鼠模型，用于在體實驗研究。
　　2.神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定及尼氏染色
　　缺血再灌注損傷24小時后進(jìn)行神經(jīng)功能評分、腦梗死體積檢測及尼氏染色。觀察芝麻素對神經(jīng)功能與腦缺血再灌損傷后的保護(hù)作用。
　　3.小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)及NMDA損傷模型的建立
　　培養(yǎng)胎鼠大腦皮層神經(jīng)元，并建立 NMDA損傷模型。在體外條件下觀察芝麻素對神經(jīng)

3、元的保護(hù)作用。
　　4. MTT、Hoechst/PI法
　　皮層神經(jīng)元給予NMDA損傷及芝麻素治療后，采用MTT以及Hoechst/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡及壞死比例。
　　5.鈣離子成像檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度
　　采用鈣離子成像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度變化。觀察芝麻素是否能夠減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。
　　6. Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)
　　采用western blot法檢測各

4、組Bcl-2、Bax以及pro-caspase-3的蛋白表達(dá)水平變化，分析芝麻素可能的作用機(jī)制。
　　7.慢性炎性痛模型的建立
　　將10μl50％CFA溶液注射至小鼠左后側(cè)腳拓中部建立小鼠慢性炎性痛模型，對照組小鼠注射10μl0.9%生理鹽水。
　　8.機(jī)械痛、熱痛閾值的檢測
　　采用標(biāo)準(zhǔn)的Von Frey纖維評價機(jī)械痛閾值，采用熱板實驗檢測熱痛閾值。根據(jù)結(jié)果分析芝麻素是否對小鼠慢性炎性痛后有降低痛閾值的作用。

5、
　　9.足底厚度的檢測
　　采用游標(biāo)卡尺檢測小鼠注射部位足底厚度，分析芝麻素是否有緩解慢性炎癥的作用。
　　10.高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）及曠場實驗
　　采用高架十字迷宮及曠場實驗檢測小鼠進(jìn)入開、閉臂次數(shù)和滯留時間以及在曠場中央?yún)^(qū)活動時間。從而分析芝麻素是否對慢性痛引起的焦慮有緩解作用。
　　11. Western blot
　　采用Western blot方法檢

6、測小鼠杏仁核區(qū)GABAA-α2受體和glutamate受體表達(dá)水平變化，分析芝麻素可能的抗焦慮作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.芝麻素預(yù)處理改善小鼠缺血再灌注損傷
　　神經(jīng)功能評分和腦梗死體積測定結(jié)果表明，與假手術(shù)組小鼠相比，MCAO手術(shù)組小鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死體積顯著增加，芝麻素預(yù)處理可減少小鼠 MCAO手術(shù)引起的神經(jīng)功能缺失和腦梗死體積增加。尼氏染色結(jié)果也同樣表明，芝麻素預(yù)處理能夠拮抗MCAO引起的小鼠海馬和前皮

7、層正常神經(jīng)元的數(shù)量丟失。
　　2.芝麻素預(yù)處理減少NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷
　　芝麻素能夠減少 NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低，單獨使用芝麻素對細(xì)胞活性無影響。LDH細(xì)胞毒性檢測結(jié)果進(jìn)一步驗證了芝麻素的神經(jīng)保護(hù)作用；Hoechst/PI雙染色結(jié)果表明，與對照組比，NMDA損傷組神經(jīng)元凋亡率明顯增加，芝麻素（0.1μM）顯著減少神經(jīng)元的凋亡與壞死。
　　3.芝麻素預(yù)處理抑制了NMDA誘發(fā)的神經(jīng)元內(nèi)鈣超載
　　實驗結(jié)果顯

8、示，對照組的神經(jīng)元在給予ECS后的Ca2+濃度沒有明顯變化，然而，200μM NMDA誘發(fā)了神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，0.1μM芝麻素預(yù)處理組可以明顯降低NMDA引起的Ca2+濃度升高的速度和強(qiáng)度。
　　4.芝麻素預(yù)處理對神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　Western blot結(jié)果顯示，NMDA顯著下調(diào)了神經(jīng)元中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平（P<0.01），同時上調(diào)了Bax的蛋白表達(dá)水平（P<0.01）和Bax/Bcl-2

9、比率（P<0.01）。0.1μM芝麻素預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)了NMDA引起的Bcl-2（P<0.01）、Bax（P<0.01）以及Bax/Bcl-2（P<0.01）的表達(dá)水平變化。NMDA處理后，神經(jīng)元中pro-caspase-3表達(dá)水平較對照組相比明顯下調(diào)（P<0.01）。0.1μM芝麻素上調(diào)了pro-caspase-3（P<0.05）的表達(dá)水平。
　　5.芝麻素對CFA誘導(dǎo)小鼠機(jī)械痛和熱痛痛閾的影響
　　Von Frey實驗結(jié)果

10、顯示，與正常對照組相比，CFA注射1天后，小鼠注射側(cè)足底縮足潛伏期明顯降低（P<0.01），并且這種變化一直持續(xù)到 CFA注射后21天。與CFA模型組相比，芝麻素給藥組小鼠注射側(cè)足底縮足閾值并沒有顯著變化。然而，在熱痛實驗中，與CFA模型組相比，芝麻素治療后顯著提高了注射側(cè)足底縮足閾值（P<0.01）。
　　6.芝麻素對CFA誘導(dǎo)小鼠足底厚度的影響
　　實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，CFA注射后導(dǎo)致小鼠注射部位足底厚度明顯

11、增加（P<0.01），芝麻素治療后沒有改變CFA引起的小鼠注射部位足底厚度。然而，CFA和芝麻素對小鼠對側(cè)足底厚度沒有影響。
　　7.芝麻素降低慢性炎性痛誘發(fā)小鼠焦慮樣行為
　　在高架十字迷宮測試中，與對照組相比，CFA注射21 d后小鼠的開臂滯留時間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)明顯減少（P<0.05）；而芝麻素治療組小鼠開臂滯留時間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)顯著增加（P<0.01）。三個實驗組小鼠進(jìn)入閉臂總次數(shù)沒有明顯改變。曠場實驗結(jié)果

12、顯示，與對照組相比，模型組小鼠中央?yún)^(qū)活動時間百分比顯著減少（P<0.01），芝麻素能明顯增加小鼠中央?yún)^(qū)活動時間百分比（P<0.01）。各組小鼠的總運(yùn)動距離沒有顯著差別。
　　8.芝麻素逆轉(zhuǎn)慢性炎性痛小鼠杏仁核GABAA-α2受體表達(dá)下調(diào)
　　Western blot結(jié)果顯示：與正常對照組相比,炎性痛模型小鼠杏仁核內(nèi)GABAA-α2受體表達(dá)明顯降低（P<0.01），GAD67（谷氨酸脫羧酶，GABAergic神經(jīng)元的標(biāo)記）蛋白

13、表達(dá)沒有明顯變化。芝麻素組明顯逆轉(zhuǎn)了CFA誘導(dǎo)的GABAA-α2受體表達(dá)下調(diào)（P<0.05），而對GAD67蛋白的表達(dá)沒有影響。
　　9.芝麻素逆轉(zhuǎn)慢性炎性痛小鼠杏仁核glutamate受體表達(dá)上調(diào)
　　CFA注射21天后，AMPA受體亞型 GluR1和磷酸化 GluR1在831位點（p-GluR1-Ser831）的表達(dá)顯著增加（P<0.01）；NMDA受體亞型NR2B表達(dá)明顯增加（P<0.01），但NR2A表達(dá)沒有差異。C

14、FA注射后CaMKIIα蛋白的表達(dá)也明顯增加（P<0.01）。芝麻素明顯抑制了CFA引起上述蛋白水平的變化，顯著降低了GluR1、p-GluR1-Ser831、NR2B和CaMKIIα的表達(dá)水平，但沒有影響NR2A受體的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　本實驗結(jié)果初步表明，芝麻素通過降低鈣離子超載、逆轉(zhuǎn)Bcl-2、pro-caspase-3表達(dá)下調(diào)以及Bax過表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。CFA注射21天小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為并伴有杏仁核腦