安神方抗焦慮作用的療效觀察及相關機制研究.pdf

1、進入21世紀以來，隨著社會發(fā)展進程的加快競爭日趨激烈，生活、學習、工作等壓力也隨之不斷加大，人們在不同程度上普遍感受到了精神壓力，聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織預測指出，精神病學以及心理衛(wèi)生將越來越受到人們的重視。據(jù)統(tǒng)計在10種造成社會最沉重負擔的疾病中，精神疾病占了4種，精神疾病的總負擔占全部疾病負擔的1/4，精神醫(yī)學正在逐步受到醫(yī)學同行及社會的關注并被賦予新的認識?，F(xiàn)在人們對精神健康的關注也從以往的重型精神障礙逐漸向輕型轉(zhuǎn)變。
　　 焦

2、慮是精神障礙五大癥狀群中常見的一種，焦慮障礙作為神經(jīng)癥的一個獨立的亞型，其發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年上升趨勢。焦慮障礙又稱焦慮癥，其主要有兩種臨床形式-廣泛性焦慮障礙和驚恐障礙。廣泛性焦慮障礙(generalizedanxietydisorder，GAD)又稱慢性焦慮癥，其主要表現(xiàn)為對實際并不存在的威脅或危險以及身體健康過分的擔心、緊張和害怕，并伴有口干、胃腸不適、惡心、腹瀉、呼吸困難、心悸、尿頻尿急、男性陽痿、女性月經(jīng)不調(diào)、出汗、面色潮紅及肌肉

3、緊張、手顫、頭痛、坐立不安等癥狀，另外還伴有注意力不集中、記憶力減退、睡眠障礙等癥狀。
　　 隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和社會文明的進步，人們早已消除了對精神疾病的狹隘誤解，正確的認識使得人們對自我心理健康的關注程度有了較大提高，因覺察到自身焦慮癥狀而主動就醫(yī)的人數(shù)越來越多，焦慮障礙已經(jīng)成為綜合醫(yī)院門診、心理咨詢和治療機構中常見的一類疾病。越來越多患有焦慮癥狀的人群希望能夠得到及時、有效的診斷和治療，為此，全球各國醫(yī)務工作者正在積極開展對

4、焦慮障礙發(fā)病機制以及預防治療方案等方面的研究。
　　 目前，現(xiàn)代醫(yī)學在對焦慮障礙的發(fā)病機制研究方面已經(jīng)取得了很大進展，藥物治療方面也已具備了較為完善的理論。臨床治療多采用以地西泮為代表的苯二氮卓類藥物和丁螺環(huán)酮等非苯二氮卓類藥物，前者在使用初期起效很快但常伴有嗜睡、便秘、肌松、記憶力減弱等副作用，后者雖副作用較少，但起效通常較慢，另外該類藥物由于容易形成依賴和耐受以及戒斷反應等因素，故也在一定程度上限制了應用。因此，尋找療效確切

5、、副作用小的抗焦慮藥物就成為了目前抗焦慮研究領域的重要課題。
　　 我們的課題研究首先通過收集查閱大量相關文獻，在學習借鑒現(xiàn)代醫(yī)學對焦慮障礙的研究現(xiàn)狀之后，找到了焦慮障礙與中醫(yī)學情志病之間的相關性和共同點，并在總結(jié)了中醫(yī)學歷代、各學派學者對情志病的調(diào)治方法的基礎之上，在博士生導師、知名中醫(yī)陳寶田教授指導下，確立了清熱除焦、調(diào)和營衛(wèi)、安神定志的治療原則，制定了安神方(ASF)的組方用藥。教授結(jié)合個人近50年臨床經(jīng)驗，在安神方中配伍

6、運用柴胡、酸棗仁、桂枝、龍骨、牡蠣等藥物，用于治療焦慮癥見焦躁易怒、胸脅脹悶、驚悸不安、失眠健忘、肢體困乏、口苦咽干、舌紅脈弦數(shù)的患者。此次研究通過觀察安神方治療廣泛性焦慮障礙(GAD)的臨床療效、并進一步通過動物試驗探討安神方治療焦慮障礙的藥效學及相關作用機制。旨在充分發(fā)揮祖國醫(yī)學整體觀念、辨證論治這些優(yōu)勢特點的同時，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學的實驗方法，更好的解釋其作用效果及機理，為更好的治療焦慮障礙探索鋪就出一條有效之路。
　　 一、安

7、神方治療廣泛性焦慮障礙(GAD)的療效觀察
　　 1.目的:通過臨床觀察探討安神方治療廣泛性焦慮障礙(GAD)的臨床效果，觀察癥侯及臨床整體療效以及收集整理相關檢查所得的結(jié)果，客觀的評價安神方治療GAD的臨床療效。
　　 2.方法:
　　 2.1病例與分組:將符合納入標準的120例GAD入組患者隨機分為治療組和對照組，每組60例;
　　 2.2用藥:治療組口服“安神方”（由南方醫(yī)院中藥房提供，方劑組成為:

8、柴胡25g，桂枝10g，黃芩10g，黨參15g，白芍15g，生龍骨30g，生牡蠣30g，炒棗仁15g，遠志10g，夜交藤30g，甘草10g等），每日1劑，分2次，晨起空腹及晚睡前30min各服一次:對照組口服地西泮（由天津利生制藥股份有限公司提供，2.5g/片，100片/瓶）口服，1片/次，晨起空腹及晚睡前30min各服一次。兩組均以連續(xù)服藥4周為1個療程。治療期間不同用其他抗焦慮及鎮(zhèn)靜安眠藥。兩組均于診療中同時注意對患者進行必要的心理

9、疏導，避免情緒波動。
　　 2.3改變指標:分別于治療前及治療后1、2、4周末各進行一次漢密爾頓焦慮量表(HAMA)評定。以HAMA減分率(T)作為療效評定指標，T＝（治療前總分-治療后總分）/治療前總分×100％。T小于25％為無效，25％～49％為好轉(zhuǎn)，50％～75％為顯著好轉(zhuǎn)，大于75％為臨床痊愈;總有效率=（痊愈+顯著+好轉(zhuǎn)）/總例數(shù)×100％。
　　 2.4臨床整體療效、不良反應及安全性判定:以漢密爾頓焦慮量表

10、(HAMA)和副反應量表(TESS)評價療效和不良反應及其程度。并于治療前后檢查:體溫，心率，血壓，呼吸:血、尿、便常規(guī);肝、腎功能;心電圖等項目，以此對兩組服藥后的不良反應以及藥物的安全性進行全面的評價。
　　 2.5統(tǒng)計學方法:采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學處理和分析。試驗數(shù)據(jù)計量資料采用均數(shù)加減標準差((x)±S)表示。治療前后劑量資料比較采用配對樣本t檢驗;兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗:治療后組間癥候療效

11、比較采用協(xié)方差分析;等級資料分布情況采用秩和檢驗及非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以百分率表示，采用卡方檢驗。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以P＜0.05作為有顯著性差異的界限。
　　 3.結(jié)果:治療4周后，兩組HAMA分值均較治療前有顯著差異（P均＜0.01），兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療組與對照組TESS量表評分比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.結(jié)論:初步確認了安神方治療GAD安全、有效且不良反應較小，值得進

12、一步研究推廣。
　　 二、安神方抗焦慮作用的藥效學研究
　　 1.目的:選用大鼠高架十字迷宮試驗模型(EPM)，觀察安神方的抗焦慮作用。
　　 2.方法:將60只健康雄性Wistar大鼠隨機分為6組（10只/組）:正常對照組、模型組、地西泮組(DZP)和安神方(ASF)高、中、低劑量組。采用慢性情緒應激的方法建立焦慮大鼠模型，同時給予藥物干預，以國際公認的高架十字迷宮試驗對其進行藥效行為學評價。正常對照組不接受任

13、何處理，自由飲水和攝食。其余各組定時喂水訓練7天，之后開始應激試驗，在上述兩個時間段內(nèi)給予不確定空瓶刺激，維持1天1次或2次，持續(xù)2周。在不確定空瓶刺激期間，地西泮組給予1mg/kg灌胃，模型組每天給予等容積生理鹽水，ASF高、中、低劑量組每天劑量分別為:40g/kg、20g/kg、10g/kg。于第21天，ASF組末次給藥2h、模型組及DZP組末次給藥0.5h后，進行高架十字迷宮行為學測定，大鼠均提前2h進入測試實驗室適應環(huán)境。

14、>　　 3.儀器:大鼠高架十字迷宮(EPM)采用國際通用的方法制作。
　　 4.統(tǒng)計學方法:試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK法。試驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差((x)±S)表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 5.結(jié)果:與正常對照組比較，模型組大鼠進入開臂的時間百分率（OT％）、次數(shù)百分率(OE％)均明顯減少;DZP組與ASF高、中、低劑量組大鼠進入開臂的

15、時間百分率(OT％)、次數(shù)百分率(OE％)均較模型組顯著上升，其中以ASF中劑量組上升最明顯。
　　 6.結(jié)論:行為學試驗結(jié)果顯示:DZP組、ASF高、中、低劑量組同模型組比較，EPM中大鼠OE％和OT％值均升高(P＜0.05)，尤其是ASF中劑量組升高最明顯(P＜0.01)，其作用效果與DZP相當，這進一步證實了ASF對大鼠焦慮狀態(tài)的干預作用，而且以中劑量給藥干預效果最好。
　　 三、安神方抗焦慮作用的形態(tài)學及相關機制

16、研究
　　 1.目的:觀察安神方(ASF)的抗焦慮作用，并初步研究其機制。
　　 2.方法:①.將所取雄性Wistar大鼠隨機平均分為6組:正常對照組、模型組、DZP組和ASF高、中、低劑量組;
　　 ②.采用慢性情緒應激的方法建立焦慮大鼠模型，同時給予藥物干預，以國際公認的高架十字迷宮模型(EPM)試驗對其行為學進行評價;
　　 ③.行為學觀察后，將正常對照組、模型組、DZP組及ASF高、中、低劑量組大

17、鼠立即麻醉處死、斷頭，于冰臺上剝離大鼠的海馬組織。
　　 ④.在光學顯微鏡下采用HE染色法觀察大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構的改變和膠質(zhì)細胞的增生情況;用尼氏染色法觀察神經(jīng)元受損和尼氏體的丟失情況。
　　 ⑤.用免疫組化法觀察ASF對焦慮大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)——γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的影響;
　　 ⑥.用Westernbolt法觀察ASF對焦慮大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)受體——GAB

18、A(A)受體(GABA(A)Rα1)和Glu受體(N-甲基-D-天冬氨酸受體1即NMDAR1)表達的影響;
　　 ⑦.用熒光定量PCR法觀察ASF對焦慮大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)受體——GABA(A)受體(GABA(A)Rα1)和Glu受體(N-甲基-D-天冬氨酸受體1即NMDAR1)基因表達的影響。
　　 3.儀器:MilliQS純水/超純水系統(tǒng)、6219型PH計、BCD-196DT冰箱、CR703恒溫振蕩器、SFG

19、-02B電熱恒溫干燥箱、TS-1脫色搖床、EoipseTi-s倒置顯微鏡、MI-22FOEGC微波爐、RF2000熒光檢測器、PHS-2C精密酸度計、Avanti30冷凍離心機、BA110S電子天平、TiThermocyclerRea-timepCR儀、CA-92-2垂直層流潔凈工作臺、DYCP水平電泳槽、DYY6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、sigma3K30超速冷凍離心機、MX3005P熒光定量PCR儀及分析軟件MXPr04.01
　　

20、 4.試劑:PBS緩沖液(ph7.2-7.4)、高效切片石蠟、中性甲醛、無水酒精、二甲苯、濃鹽酸、蘇木精、伊紅染、中性樹脂、50ml離心管、普通玻片、蓋玻片、玻片盒、玻片架、谷氨酸(Glu)購自美國SIGMA，公司批號分別為43907190;γ-氨基丁酸(GABA)購自美國SIGMA公司，公司批號116K5005;乙腈購自美國TEDIA公司;GABA(A)Ra1兔IgG多克隆抗體購自美國santacurz公司;N-甲基-D-天冬氨酸受

21、體1(NMDAR1)兔IgG多克隆抗體購自美國santacurz公司;2mlPCR熒光管購自Axgen公司;Nalater:AMBION公司;2000bpDNALadder:廣州瑞真生物科技有限公司;焦碳酸二乙醋(DEPC)treatedwater:大連TaKaRa寶生物公司;Trizol:Invitrogen公司、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒:Takara公司、SyBrI熒光定量試劑盒購自Genecopoeia公司、瓊脂糖購自Sigma公司，其

22、余試劑均為進口及國產(chǎn)分裝試劑。
　　 5.統(tǒng)計學方法:試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK法。試驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差((X)±S)表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 6.結(jié)果:
　　 ①.正常對照組:海馬CA3區(qū)細胞排列整齊，細胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細胞排列整齊，層次緊密，尼氏體深染;模型組:海馬CA3區(qū)錐體細胞排列紊亂，神經(jīng)細胞出現(xiàn)

23、明顯的病理變化，染色質(zhì)溶解，部分細胞脫失，胞體固縮呈多角形或不規(guī)則形，胞質(zhì)濃縮核膜界限不清，錐體細胞排列松散，細胞缺失，尼氏體淺染甚至溶解;DZP組:海馬CA3區(qū)錐體細胞排列比較整齊，少部分神經(jīng)細胞出現(xiàn)病理變化，少部分細胞染色質(zhì)溶解，少部分胞體固縮呈不規(guī)則形，錐體細胞排列部分松散，錐體細胞與中劑量組相當，細胞部分缺失;ASF低、中、高劑量組:海馬CA3區(qū)錐體細胞排列比較整齊，神經(jīng)細胞部分出現(xiàn)病理變化，部分細胞染色質(zhì)溶解，部分細胞脫失，胞

24、體固縮呈不規(guī)則形。其中中劑量組細胞形態(tài)修復最好，ASF低劑量組錐體細胞排列比較整齊，比模型組錐體細胞明顯增多，細胞部分缺失，尼氏體淺染;ASF中劑量組錐體細胞排列比較整齊，錐體細胞與高劑量組相當，細胞部分缺失，尼氏體染色較高劑量組深染，與DZP劑量組相當;ASF高劑量組錐體細胞排列比較整齊，比低劑量錐體細胞有所增多，細胞部分缺失，尼氏體淺染。
　　 ②.模型組大鼠海馬組織中Glu的表達量較正常對照組顯著上升，GABA的表達量明顯

25、下降;地西泮組和安神方中劑量組同模型組比較，大鼠海馬組織中Glu的表達量顯著降低和GABA的表達量明顯提高，安神方中劑量組與地西泮組比較差異不顯著;
　　 ③.模型組與正常對照組比較，GABA(A)受體表達減少，Glu受體表達增多;地西泮組和安神方高、中、低劑量組分別同模型組進行比較，Glu受體的表達水平均降低，GABA(A)受體的表達水平均提高;安神方中劑量組與地西泮組比較無明顯差異。
　　 ④.模型組與正常對照組比較

26、，GABA(A)受體基因減少，Glu受體基因增多;地西泮組和安神方高、中、低劑量組分別同模型組進行比較，Glu受體基因水平均降低，GABA(A)受體受體基因水平均提高;安神方中劑量組與地西泮組比較無明顯差異。
　　 7.結(jié)論:安神方具有抗焦慮的作用，具體表現(xiàn)在:
　　 ①可以修復焦慮模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬區(qū)出現(xiàn)的病理性變化;
　　 ②可以提高大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA的含量，降低Glu的含量;