NEDL1基因敲除小鼠模型的建立以及表現(xiàn)型分析.pdf

1、研究目的:
　　泛素蛋白連接酶在各種重要的生理病理過程中都發(fā)揮著重要的作用，NEDL1（NEDD4-like ubiquitin protein ligase-1）作為一種泛素蛋白連接酶目前相關(guān)的研究還很不充足。已有的研究發(fā)現(xiàn)它特異性表達于神經(jīng)系統(tǒng)，它還可以通過其下游靶點對細胞凋亡、腫瘤發(fā)生以及目標蛋白的泛素化降解產(chǎn)生影響。這些研究多為體外實驗，因此我們將建立NEDL1基因敲除小鼠（NEDL1-/-）模型，并且對其表現(xiàn)型進行在體研

2、究，為發(fā)現(xiàn)NEDL1的功能以及可能的作用機制提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.使用Cre/LoxP系統(tǒng)建立NEDL1-/-模型，之后通過PCR技術(shù)以及western blot技術(shù)驗證目標基因片段是否被成功敲除并且是否伴隨蛋白表達量的降低。
　　2.通過免疫熒光染色以及免疫組化等方法，對神經(jīng)系統(tǒng)細胞進行染色，觀察NEDL1對神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)各種細胞發(fā)育的影響。
　　3.通過Barnes迷宮、三箱實驗、高架十字以及sel

3、f-grooming等實驗，觀察不同基因型小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)差異（包括學(xué)習(xí)能力、社會交往能力、焦慮行為、重復(fù)刻板行為等）。
　　4.通過膜片鉗對不同基因型小鼠的腦片進行長時程增強(long term potentiation，LTP)、微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current，mEPSCs)以及微小抑制性突出后電流(miniaure inhibitory postsyn

4、aptic current，mIPSCs)等指標的檢測，觀察NEDL1敲除后對小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)細胞興奮性以及突觸可塑性的影響。
　　5.通過LC-MS/MS方法對小鼠血液樣本進行氨基酸肉堿代謝譜的檢測，觀察NEDL1基因和上述代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，以便對NEDL1作用于何種代謝產(chǎn)物以及通過什么作用機制發(fā)揮作用進行研究。
　　6.通過高通量RNA測序的方法對小鼠腦組織樣本進行轉(zhuǎn)錄組研究，觀察NEDL1基因可能的作用靶點以及可以通

5、過什么樣的機制發(fā)揮作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建NEDL1-/-小鼠，靶基因片段成功敲除并且伴隨目標蛋白表達量的降低。
　　2.NEDL1-/-小鼠和野生型（NEDL1+/+）小鼠相比，其成年之前的膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增加。
　　3.在行為學(xué)方面，NEDL1-/-小鼠與NEDL1+/+小鼠相比具有明顯的刻板行為。
　　4.在電生理學(xué)特點方面，NEDL1-/-小鼠和NEDL1+/+小鼠相比，mEPSC、

6、mIPSC以及LTP等指標沒有顯著差異。
　　5.在氨基酸肉堿代謝譜方面，NEDL1-/-小鼠和NEDL1+/+小鼠相比具有明顯的代謝譜差異，相關(guān)的差異功能主要是氨基酸代謝、利用以及蛋白質(zhì)合成等。
　　6.在轉(zhuǎn)錄組方面，NEDL1-/-小鼠和NEDL1+/+小鼠相比具有明顯的差異，主要的差異功能為腫瘤形成、神經(jīng)系統(tǒng)興奮性以及腦發(fā)育等。
　　研究結(jié)論:
　　我們成功構(gòu)建了NEDL1-/-小鼠，它具有在成年之前膠質(zhì)細