GPS2基因敲除小鼠模型建立及表型分析.pdf

1、GPS2（G蛋白通路抑制因子-2）蛋白最初是在酵母中篩選到的Ras通路抑制因子。體外研究發(fā)現(xiàn)GPS2廣泛參與炎癥，肥胖，膽固醇代謝，紅系分化，腦形態(tài)發(fā)生等多種生物學(xué)過程，但體內(nèi)水平研究尚缺乏報(bào)道，所需的內(nèi)源抗體也很匱乏。
　　我們首先制備了小鼠GPS2抗體。從鼠精巢中克隆了GPS2 cDNA，并先后構(gòu)建于過度用載體pMD18-T-GPS2載體和最終的目的原核表達(dá)載體pET28b-GPS2重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)

2、并獲得重組GPS2-His蛋白質(zhì)，用該蛋白質(zhì)分別免疫新西蘭大白兔和昆明小鼠，成功獲得了GPS2兔多克隆抗體和13株鼠單克隆抗體的融合細(xì)胞株，并證實(shí)獲得的抗體可以識別小鼠內(nèi)源性GPS2蛋白。GPS2抗體的成功制備為后續(xù)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為深入研究GPS2在體內(nèi)的生理功能，本論文利用ZFNs(鋅指核酸酶)技術(shù)建立了C57BL/6品系的GPS2+/-小鼠。通過對GPS2+/-小鼠雜交后代的表型分析，發(fā)現(xiàn)GPS2-/-小鼠胚胎致死

3、。發(fā)生的主要變化有發(fā)育阻滯，胚體明顯偏小，部分胚胎體節(jié)翻轉(zhuǎn)延遲，胚體缺血或局部出血，血管發(fā)育不全，心包膜膨大，卵黃囊血管缺失或發(fā)育不全，Reichert’s膜出現(xiàn)血塊，胎盤發(fā)育受阻，部分胚胎尿囊與絨毛膜未融合。
　　為了進(jìn)一步明確GPS2-/-小鼠胚胎致死的分子機(jī)制，首先利用Real-time PCR及Western blot檢測了GPS2在C57BL/6小鼠各組織和器官中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)GPS2廣泛表達(dá)于各組織中，并在精巢、肺、骨

4、髓等器官中高水平表達(dá)。全胚TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPS2-/-胚胎細(xì)胞凋亡增加，同利用Caspase3抗體進(jìn)行的全胚免疫熒光檢測結(jié)果相同。用血管特異marker CD31進(jìn)行全胚免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)GPS2-/-胚胎血管端部毛細(xì)血管彌散，未形成良好的脈管結(jié)構(gòu)。提取胚胎總RNA，檢測相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)造血調(diào)控相關(guān)基因gata1、lmo2在GPS2-/-胚胎中表達(dá)下調(diào)，而血管發(fā)育相關(guān)基因c-met表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示我們GPS2在胚胎發(fā)育中可能