小鼠Prestin基因表達(dá)及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析.pdf

1、本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因克隆、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等方法，研究了prestin基因在各組織中的表達(dá)和差異，對(duì)該基因不同轉(zhuǎn)錄變異體對(duì)應(yīng)的不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了深入分析，并結(jié)合生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)了相關(guān)順式調(diào)控元件和調(diào)控因子，獲得以下結(jié)果:
　　(1)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)prestin基因在大腦、睪丸和耳蝸中總體表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)prestin除了在耳蝸中特異性高表達(dá)外，在小鼠睪丸和大腦中也有表達(dá)。隨后檢測(cè)了prestin基

2、因轉(zhuǎn)錄變異體1表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)除了耳蝸外，大腦和睪丸中同樣存在著不同的轉(zhuǎn)錄變異體表達(dá)，轉(zhuǎn)錄變異體1在耳蝸、大腦和睪丸組織中分別占總表達(dá)量的58.08％、43.77％、62.91％。
　　(2)通過(guò)分析prestin基因已知的3種mRNA序列，針對(duì)不同轉(zhuǎn)錄變異體設(shè)計(jì)了特異性片段擴(kuò)增，定性的研究該基因不同轉(zhuǎn)錄變異體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耳蝸、大腦、睪丸、GC-1spg細(xì)胞中prestin基因均有轉(zhuǎn)錄本1的表達(dá)，在耳蝸中也擴(kuò)增出轉(zhuǎn)錄變異體2或3。結(jié)合

3、5'RACE實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出睪丸中prestin基因mRNA的5'端序列，發(fā)現(xiàn)prestin基因在睪丸中表達(dá)轉(zhuǎn)錄變異體2或3，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他未知的轉(zhuǎn)錄變異體。
　　(3)通過(guò)克隆prestin基因5'端DNA序列，構(gòu)建了啟動(dòng)子1和啟動(dòng)子2缺失片段載體，運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子1在GC-1spg小鼠精原細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性較低，而啟動(dòng)子2的轉(zhuǎn)錄活性較高。第一外顯子上游-280bp到-765bp以內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄

4、激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，-765bp到-1096bp內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控元件，第二外顯子上游-952bp內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控元件，-952bp到-1954bp內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控元件。
　　(4)結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了上述調(diào)控區(qū)潛在的大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA-3，-2，-1潛在的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合已有報(bào)道，推測(cè)其可能在小鼠精原細(xì)胞中調(diào)控prestin基因的表達(dá)。
　　本研究分析了prestin基因在耳蝸、睪丸