山羊DCT基因啟動(dòng)子活性區(qū)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件探究.pdf

1、山羊DCT基因是調(diào)控山羊毛色的候選基因之一，目前市場(chǎng)上現(xiàn)有的彩色羊毛（絨）制品均是由化工染料染色而成，這不僅污染了自然環(huán)境，而且對(duì)人類(lèi)身體健康會(huì)造成嚴(yán)重危害。若能通過(guò)對(duì)毛色基因的研究人為的控制動(dòng)物毛色的改變，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
　　本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)山羊DCT基因5'側(cè)翼區(qū)序列及第一外顯子區(qū)序列特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控元件，包括TATA box，GC box，M box，CAAT box，CpG島和32 bp元

2、件。下載人和小鼠DCT基因啟動(dòng)子序列，與山羊DCT基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)-648～+73 bp與人DCT基因啟動(dòng)子相似度較高(81％)，-472～-28bp與小鼠DCT基因啟動(dòng)子相似度較高(78％)。根據(jù)以上生物信息學(xué)分析，結(jié)合在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果，利用普通分子克隆的方法構(gòu)建了5個(gè)5'端缺失序列的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)區(qū)報(bào)告基因載體，以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，雙熒光素酶檢測(cè)試劑檢測(cè)啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，片段P3（-990～+232 bp）的活

3、性最高，初步將核心啟動(dòng)子區(qū)定位在這一區(qū)域。以P3片段序列為模板，采用閃電克隆的方法構(gòu)建了6個(gè)3'端缺失序列的報(bào)告基因載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，檢測(cè)啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，片段P8(-881～-154bp)的啟動(dòng)子活性最高，且極顯著高于片段P3(P＜0.01)，因此可確定，-881～-154 bp區(qū)域?yàn)樯窖駾CT基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。
　　以片段P8為模板，構(gòu)建SOX10、MITF和OTX2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變的6個(gè)報(bào)告基因載體，結(jié)

4、果SOX10結(jié)合位點(diǎn)突變的載體啟動(dòng)子活性極顯著降低(P＜0.01)，MITF和OTX2結(jié)合位點(diǎn)突變的載體啟動(dòng)子活性極顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。表明轉(zhuǎn)錄因子SOX10對(duì)山羊DCT基因轉(zhuǎn)錄起到正調(diào)控作用，轉(zhuǎn)錄因子MITF和OTX2對(duì)山羊DCT基因調(diào)控作用尚需深入研究。
　　利用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法檢測(cè)了黑色和白色山羊-184 bp～+14 bp和+386bp～+665bp位置CpG島的甲基化水平，共發(fā)現(xiàn)了32個(gè)甲基化位點(diǎn)，-184 b

5、p～+14 bp區(qū)域兩種毛色山羊平均甲基化水平差異不顯著（P＞0.05），+386 bp～+665 bp區(qū)域白色山羊平均甲基化水平極顯著高于黑色山羊(P＜0.01)。其中，+476 bp、+516bp和+564 bp位置白色山羊甲基化水平顯著高于黑色山羊(0.01＜P＜0.05)，+553bp和+568bp位置白色山羊甲基化水平極顯著高于黑色山羊（P＜0.01）。結(jié)果表明，+386bp～+665 bp區(qū)域DNA甲基化可能造成白色山羊DC

6、T基因的低表達(dá)。
　　對(duì)唐山奶山羊、濟(jì)寧青山羊、南江黃羊快長(zhǎng)系和南江黃羊黑色系4個(gè)山羊品種各20個(gè)個(gè)體的DCT基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR測(cè)序，發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，分別位于-640 bp、-550 bp、-543 bp和-517bp。其中，-640 bp位點(diǎn)TT基因型，-543 bp位點(diǎn)TT基因型，-517 bp位點(diǎn)GG基因型可能與山羊深色被毛形成有關(guān);-640bp位點(diǎn)GG基因型，543 bp位點(diǎn)CC基因型，-517bp位點(diǎn)AA基因

7、型與白色被毛形成有關(guān);-550bp位點(diǎn)CC基因型可能與山羊青色被毛形成有關(guān)。
　　綜上，-881～-154 bp區(qū)域?yàn)樯窖駾CT基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄因子SOX10對(duì)其轉(zhuǎn)錄起到正調(diào)控作用，白色山羊+386 bp～+665bp區(qū)域DNA的高甲基化可能造成白色山羊DCT基因的低表達(dá)。DCT基因上游-640 bp、-550bp、-543bp和-517 bp位點(diǎn)的4個(gè)SNP在不同毛色山羊中的基因型分布差異與毛色特征的關(guān)系需進(jìn)一步深入研究