NADPH氧化酶p40phox亞基在小鼠抗細(xì)菌感染中的作用機(jī)理研究.pdf

1、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是一種位于細(xì)胞質(zhì)膜的多亞基復(fù)合體，是機(jī)體生成活性氧(ROS)的主要酶類之一。NADPH氧化酶在清除病原微生物和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，其功能異常將導(dǎo)致機(jī)體抗感染能力降低而引起炎性損傷。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium，S.Typhimurium)是腸桿菌科的兼性胞內(nèi)寄生菌，因其對人類、畜禽飼養(yǎng)業(yè)造成嚴(yán)重危害而受到廣泛重視。沙門氏

2、菌可以通過腸上皮組織進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)，擴(kuò)散至循環(huán)系統(tǒng)，引起腸道及全身性免疫應(yīng)答反應(yīng)。不同于胞內(nèi)致病菌沙門氏菌，鼠檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium，C.rodentium）是一種通過粘附脫落損傷效應(yīng)(attaching and effacing，A/E)引起鼠類暫時性結(jié)腸炎的病原菌。因此，本研究擬以NADPH氧化酶p40phox亞基缺陷小鼠為研究對象，探討p40phox亞基對機(jī)體抗沙門氏菌和檸檬酸桿菌感染能力的影響，

3、闡明其調(diào)控機(jī)體免疫功能的作用機(jī)理。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　?。ㄒ唬﹑40phox亞基缺失對小鼠抗全身性沙門氏首感染的影響
　　對6至8周齡p40phox-/-和C57BL/6雌性小鼠灌胃感染3×108 CFU鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)，研究p40phox亞基缺失對小鼠抗沙門氏菌感染的影響。實驗結(jié)果表明:(1)感染S.Typhimurium后，p40phox-/-小鼠死亡率顯著提高而體重顯著降低，其脾臟及

4、肝臟載菌量均顯著高于對照組C57BL/6小鼠;(2) p40phox亞基缺失加重了S.Typhimurium感染引起的脾臟及肝臟組織病理損傷，顯著提高了感染組織內(nèi)炎性因子白介素IL-1β和腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)水平;(3)與對照小鼠相比，p40phox-/-小鼠脾臟組織內(nèi)CD4+T細(xì)胞、CD11 b+F4/80+巨噬細(xì)胞及Ly6G+CD11b+中性粒細(xì)胞浸潤均顯著增加，角化細(xì)胞趨化因子KC、單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1和巨噬細(xì)胞炎癥

5、蛋白MIP-2的基因表達(dá)水平也顯著上調(diào);(4)對p40phox-/-小鼠腹膜內(nèi)注射5000 CFU沙門氏菌后，其募集炎性細(xì)胞向感染部位聚集的功能未受影響。以上結(jié)果提示，p40phox亞基在小鼠抵御全身性沙門氏菌感染方面具有重要作用。
　　（二）p40phox亞基缺失對沙門氏菌感染所致的結(jié)腸炎的影響
　　對鏈霉素預(yù)處理的p40phox-/-和C57BL/6小鼠灌胃感染1×108 CFU鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium

6、)，研究p40phox亞基缺失對小鼠沙門氏菌結(jié)腸炎的影響。實驗結(jié)果表明:(1)感染S.Typhimurium后，p40phox-/-小鼠腸道病理損傷更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為黏膜水腫嚴(yán)重、絨毛結(jié)構(gòu)破壞以及炎性細(xì)胞的大量浸潤;(2) p40phox亞基缺失促進(jìn)了S.Typhimurium感染所致的鈣黏附蛋白E-cadherin和閉鎖小帶蛋白ZO-1再分布，顯著提高了p40phox-/-小鼠肝、脾、MLN組織載菌量;(3)感染S.Typhimuriu

7、m后，p40phox-/-小鼠腸道內(nèi)黏液蛋白MUC2及唾液酸轉(zhuǎn)移酶St3ga14的基因表達(dá)水平顯著低于C57BL/6對照組，且S.Typhimurium感染未能顯著上調(diào)p40phox-/-小鼠腸道內(nèi)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT9的基因表達(dá);(4) p40phox亞基缺失顯著提高了盲腸黏膜固有層內(nèi)F4/80+巨噬細(xì)胞和Ly6G+中性粒細(xì)胞的浸潤，且浸潤細(xì)胞多聚集于腸上皮細(xì)胞基底側(cè)。以上結(jié)果提示，p40phox亞基在維持腸道屏障功能及緩解沙門氏菌引起

8、的細(xì)菌性結(jié)腸炎方面發(fā)揮重要作用。
　?。ㄈ﹑40phox亞基缺失對小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能的影響
　　本實驗以p40phox-/-和C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為材料，研究p40ph似亞基缺失對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。實驗結(jié)果表明:(1) p40phox亞基敲除后對細(xì)胞吞噬功能沒有影響，但其殺菌能力受到顯著抑制;(2) p40phox亞基缺失的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧ROS的能力顯著下降;(3) p40ph似-/巨噬細(xì)

9、胞的自噬功能受損，表現(xiàn)為微管相關(guān)蛋白輕鏈LC3、自噬相關(guān)蛋白Atg3、Atg12-Atg5復(fù)合物的表達(dá)水平顯著降低，自噬體與S.Typhimurium的共定位也顯著減少;(4)p40phox-/-巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β的含量及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-1活性顯著高于對照組，表明p40phox亞基缺失誘導(dǎo)了炎性小體的過度活化。以上結(jié)果提示，p40phox亞基對維持巨噬細(xì)胞正常的免疫功能具有重要作用。
　　（四）p40phx

10、亞基缺失對小鼠抗檸檬酸桿菌感染的影響
　　對6至8周齡p40phox-/-和C57BL/6雌性小鼠灌胃感染5×108 CFU檸檬酸桿菌（C.rodentium），研究p40phox亞基缺失對檸檬酸桿菌感染誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的影響。實驗結(jié)果表明:(1)感染C.rodentium后，p40phox亞基缺失對小鼠體重及細(xì)菌清除率無顯著影響;(2) p40phox亞基缺失對C.rodentium感染引起的腸道病理學(xué)變化、炎性因子表達(dá)及細(xì)胞浸

11、潤無顯著影響，但在未接觸病原菌的情況下p40phox-/-小鼠結(jié)腸內(nèi)炎性因子IL-1和TNF-α的表達(dá)水平及巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組C57BL/6小鼠;(3)感染C.rodentium后，p40phox-/-小鼠MLN及脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的水平顯著升高，而IL-17的含量顯著低于對照組;(4) p40phox亞基缺失顯著提高了腸道和脾臟組織內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS表達(dá)以及脾臟細(xì)胞一氧化氮的分泌。以上結(jié)果提示，p40ph