亞低溫通過(guò)Nrf2-Keap1-ARE通路減輕海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、氧化應(yīng)激是心肺復(fù)蘇（CPR）后腦損害的主要病理機(jī)制之一。目前，亞低溫（mildhypothermia，MHT）治療是唯一被臨床證實(shí)能提高患者生存率、改善神經(jīng)功能預(yù)后的治療方式，但其具體機(jī)制尚不明確。研究MHT減輕CPR后腦損傷的機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和臨床實(shí)用價(jià)值。
　　研究目的：
　　本論文擬通過(guò)建立SD新生鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen andglucose deprivation/reperfu

2、sion,OGD/R）模型，探究亞低溫（MHT）是否通過(guò)介導(dǎo)Nrf2/Keap1/ARE通路減輕海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷及其保護(hù)機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.探討Nrf2在原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷中的作用
　　1)提取新生鼠（<1d）原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，于體外培養(yǎng)第7天，隨機(jī)分組后分別建立OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型；
　　2)最佳藥物濃度的篩選：分別采用MTT法、測(cè)定

3、細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量來(lái)測(cè)定Nrf2激動(dòng)劑萊菔硫烷（SFN）、抑制劑鴉膽苦醇（BST）在不同藥物濃度下細(xì)胞的存活率、損傷程度；
　　3)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測(cè)：采用相關(guān)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的SOD活力、GSH含量和MDA含量；
　　4)采用凋亡檢測(cè)試劑盒原位檢測(cè)各組細(xì)胞DNA凋亡片段化情況，計(jì)算各處理組細(xì)胞的凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。
　　2探討MHT在原代海馬神經(jīng)元

4、細(xì)胞OGD/R損傷中的作用
　　1)提取新生鼠（<1d）原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，于體外培養(yǎng)第7天，隨機(jī)分為三組：對(duì)照組（C）、亞低溫（MHT）組、MHT+BST組，分別建立 OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型；
　　2)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測(cè)：采用相關(guān)測(cè)定試劑盒分別檢測(cè)C組、MHT組、MHT+BST組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的SOD活力、GSH含量和MDA含量；
　　3)采用凋亡檢測(cè)試劑盒原位檢測(cè)各

5、組細(xì)胞DNA凋亡片段化情況，并計(jì)算各處理組細(xì)胞的凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。
　　3探討MHT減輕原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷的分子機(jī)制
　　1)提取新生鼠（<1d）原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，于培養(yǎng)第7天,隨機(jī)分為C組、SFN組、BST組、MHT組、MHT+BST組后分別建立OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型；
　　2)Western blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞在OGD3hR0

6、h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型中HO-1、Nrf2的蛋白表達(dá)變化；
　　3)RT-qPCR分別檢測(cè)各組細(xì)胞在OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型中HO-1、Nrf2的RNA表達(dá)水平的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.探討Nrf2在原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷中的作用
　　1)綜合MTT及細(xì)胞LDH釋放量的檢測(cè)結(jié)果篩選并驗(yàn)證出SFN20μmol/l、BST40nmol/l為最佳

7、藥物濃度；
　　2)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測(cè)結(jié)果表明：與C組相比，SFN組明顯減輕細(xì)胞的氧化損傷，BST組加重了細(xì)胞的氧化損傷；
　　3)TUNEL染色結(jié)果顯示：SFN組較C組細(xì)胞狀態(tài)明顯良好，細(xì)胞凋亡指數(shù)降低；BST組較C組細(xì)胞狀態(tài)明顯更差，細(xì)胞凋亡指數(shù)升高。
　　2.探討MHT在原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷中的作用
　　1)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測(cè)結(jié)果表明：與C組相比，MHT組明顯減輕細(xì)胞

8、的氧化損傷，MHT+BST組中BST拮抗了MHT的保護(hù)作用同時(shí)加重了細(xì)胞的氧化損傷；
　　2) TUNEL染色結(jié)果顯示：Hypo組較 C組凋亡細(xì)胞減少，凋亡指數(shù)降低；Hypo+BST組較C組凋亡細(xì)胞增多，凋亡指數(shù)升高。
　　3.探討MHT減輕原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷的分子機(jī)制
　　1)Western blot結(jié)果表明：SFN組、Hypo組較C組各相應(yīng)時(shí)間段Nrf2蛋白表達(dá)增加；BST組和MHT+BST組隨R時(shí)間

9、增加Nrf2蛋白表達(dá)減少至完全阻斷表達(dá)；HO-1蛋白作為受Nrf2調(diào)控的下游蛋白，其表達(dá)趨勢(shì)與Nrf2相似。
　　2)RT-qPCR結(jié)果表明：SFN組、Hypo組較C組各相應(yīng)時(shí)間段Nrf2 mRNA、HO-1mRNA表達(dá)增加；BST組和MHT+BST組隨R時(shí)間增加Nrf2 mRNA、HO-1mRNA表達(dá)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　亞低溫可以減輕OGD/R引起的海馬神經(jīng)元損傷，這可能與激活Nrf2/Keap1/ARE通路