HIF-1α-ERK通路在微波輻射致海馬神經(jīng)元線粒體損傷中的作用研究.pdf

1、目的和意義：隨著微波技術(shù)的廣泛應(yīng)用和信息時(shí)代的到來(lái)，人們暴露于微波輻射的機(jī)會(huì)與日俱增，各種通訊設(shè)施和醫(yī)療設(shè)備的影響尤為突出。微波的生物效應(yīng)及其機(jī)制研究是目前生物電磁學(xué)的前沿課題。微波輻射具有明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷效應(yīng)，海馬是最敏感的靶區(qū)，但其致傷機(jī)制未明。線粒體結(jié)構(gòu)和功能與能量代謝密切相關(guān)，也是微波輻射最早累及的靶點(diǎn)之一，而HIF-la/ERK信號(hào)通路可能在微波輻射致海馬神經(jīng)元線粒體損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，研究微波輻射致海馬線粒體

2、損傷中HIF-la/ERK信號(hào)通路的改變及意義，將為深入研究微波輻射損傷機(jī)制和防治措施提供新靶標(biāo)和思路，對(duì)于平時(shí)作業(yè)人員的衛(wèi)生防護(hù)和現(xiàn)代高科技戰(zhàn)爭(zhēng)中作戰(zhàn)人員的安全保障具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 材料和方法：(1)采用2.5、5和10mW/cm2的微波輻射192只二級(jí)雄性Wistar大鼠，輻射時(shí)間為6min/次，5次/w，連續(xù)輻射lm。大鼠于輻射后6h、7d、14d、lm、2m和6m，采用Morris水迷宮檢測(cè)其學(xué)習(xí)和記憶能

3、力：通過(guò)HE、尼氏體染色和電鏡觀察海馬組織結(jié)構(gòu)和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化；采用高效液相色譜法檢測(cè)海馬組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化；采用Real-time PCR檢測(cè)海馬組織中hif-10[mRNA表達(dá)；通過(guò)Western Blot、免疫組織化學(xué)和圖像分析等手段檢測(cè)海馬組織中HIF-Ia、ERKl/2和p-ERKl/2表達(dá)。(2)采用30roW/cra2微波輻射經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞5min，通過(guò)電鏡、Luminometer、多功能酶

4、標(biāo)儀、熒光顯微鏡等技術(shù)，觀察PC12細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能變化；采用Real-time PCR、WestemBlot、免疫細(xì)胞化學(xué)和圖像分析等技術(shù)，檢測(cè)PC12細(xì)胞中hif-la mRNA、HIF-Ia、ERK通路分子(ERKl/2、p-ERKl/2、Raf,p-c-Raf和p-MEKl/2)、HIF-1靶基因(VEGF)、能量代謝相關(guān)基因(COX I和COXⅣ)的表達(dá)變化；通過(guò)U0126和HIF-Ia高表達(dá)質(zhì)粒的干預(yù)等手段，研究微波輻射

5、后ERK通路對(duì)HIF-Ia的調(diào)控作用以及HIF-Ia對(duì)PC12細(xì)胞線粒體功能的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)變化：輻射后7d，10mW/cm2組大鼠平均逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于假輻射組(P<0.05)；輻射后14d，5和10mW/cm2組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；輻射后lm，各輻射組與假輻射組相比，平均逃避潛伏期均延長(zhǎng)(P<0.05或P

6、h、14d和2m，海馬4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量均明顯增加（P<0.05或P<0.01）；10 mW/cm2微波輻射后6h，GABA含量降低(P<0.05)；輻射后14d和2m，Asp和Glu含量均降低(P<0.05或P<0.01)。(2)大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)和線粒體超微結(jié)構(gòu)變化：2.5、5和10mW/cm2微波輻射后6m內(nèi)，大鼠海馬組織見(jiàn)水腫、疏松，神經(jīng)元呈不同程度的變性、壞死，血管周間隙增寬。2.5和5mW/cm2輻射后7d見(jiàn)海馬損傷，I

7、m損傷最為嚴(yán)重，2m呈恢復(fù)趨勢(shì)，2.5 mW/cm2輻射后6m恢復(fù)，而5mW/cm2組仍見(jiàn)部分組織損傷；10mW/cm2組海馬結(jié)構(gòu)損傷發(fā)生早（輻射后6h），7d和14d損傷最重，6m仍未恢復(fù)。各輻射組尼氏體數(shù)量均呈不同程度減少，以10mW/cm2組最重，其變化規(guī)律與HE染色結(jié)果基本一致。5roW/cra2組輻射后6m內(nèi)，大鼠海馬線粒體腫脹、嵴斷裂，可見(jiàn)線粒體空化和畸形的線粒體；輻射后6h即見(jiàn)損傷，lm最重，6m呈恢復(fù)趨勢(shì)。(3)大鼠海馬

8、組織中hif-la mRNA和HIF-Ia蛋白變化：大鼠海馬hif-1a mRNA于2.5mW/cm2組未見(jiàn)明顯改變；5mW/cm2組于輻射后14d明顯增加(P<0.01)，輻射后lm恢復(fù)；lOmW/cm2組均低于假輻射組，以6h(P<0.01)、lm(P<0.05)和2m(P<0.05)減少顯著。大鼠海馬組織中HIF-1a蛋白于2.5mW/cm2輻射后6h和lm增加(P<0.05或P<0.01)，5mW/cm2輻射后lm增加(P．<0

9、．Ol)，10mW/cm2輻射后14d～2m降低(P<0.05或P<0.01)。(4)大鼠海馬組織中ERK1/2和p-ERKI/2表達(dá)變化：2.5、5和10mW/cm2微波輻射后2m內(nèi)，大鼠海馬ERKl/2未見(jiàn)明顯改變。假輻射組p-ERKl/2于海馬神經(jīng)元胞漿中呈弱陽(yáng)性；2.5mW/cm2輻射后2m內(nèi)，p-ERKl/2表達(dá)無(wú)明顯變化；5mW/cm2輻射后7d-lm，p-ERKl/2于海馬神經(jīng)元胞漿和胞核中呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性(P<0.05或P

10、

11、P<0.05)；輻射后1～24h，ROS均顯著高于假輻射組(P

12、2表達(dá)變化：30mW/cm2微波輻射后lh，PC12細(xì)胞中p-ERKl/2蛋白顯著增加(P<0.05)，30mW/cm2微波輻射后1～24h，PC12細(xì)胞中ERKl/2、Raf,p-c-Raf和p-MEKl/2蛋白均無(wú)明顯改變。(8) PC12細(xì)胞HIF-I靶基因VEGF和能量代謝基因cox I和Ⅳ表達(dá)變化：VEGF、COX I和Ⅳ蛋白變化與上述HIF-Ia變化呈現(xiàn)一致性，即30mW/cm2微波輻射后6h，PC12細(xì)胞VEGF、cox

13、I和Ⅳ蛋白顯著減少(P<0.05)，輻射后12h明顯增加(P<0.05)。(9) U0126干預(yù)后ERKI/2、p-ERKI/2和HIF-la表達(dá)以及線粒體功能變化：101maol/l U0126干預(yù)2h經(jīng)30mW/cm2微波輻射后lh，PC12細(xì)胞中ERKl/2無(wú)明顯改變，p-ERKl/2和HIF-la明顯降低(P<0.05)；101amol/1 U0126干預(yù)2h經(jīng)30mW/cm2微波輻射后1—24h，PC12細(xì)胞線粒體ATP含量和

14、△n降低。(10) HIF-Ict高表達(dá)質(zhì)粒及U0126干預(yù)對(duì)30mW/cm2微波輻射后PCI2細(xì)胞線粒體功能的影響：經(jīng)G418篩選后，對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N1(N)和目的質(zhì)粒pEGFP-N1-HIF-1a(H)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞效率大于90％;H組HIF-la表達(dá)顯著高于N組(P<0.01):30mW/cm2微波輻射后1～24h，H組線粒體AVm顯著升高(P<0．Ol)，SDH活性無(wú)明顯改變(P>0.05):10utmol/1 U012

15、6干預(yù)2h后經(jīng)30mW/cm2微波輻射1～24h，H組ATP含量抑制率低于N組，AtFm于輻射后lh和6h無(wú)明顯變化（P>0.05），輻射后12h和24h明顯升高(P<0.01)。
　　 結(jié)論：(1)2.5～10mW/cm2微波長(zhǎng)期輻射可使大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)尤其是線粒體結(jié)構(gòu)損傷，學(xué)習(xí)記憶能力下降，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂；上述改變與微波輻射劑量呈正相關(guān)。(2)2.5和5mW/cm2微波長(zhǎng)期輻射引起大鼠海馬組織中HIF-Ia表達(dá)增加，1

16、0mW/cm2微波輻射則使HIF-Ia表達(dá)降低；2.5-10mW/cm2微波長(zhǎng)期輻射使p-ERKl/2表達(dá)增加，表明HIF-la和ERK通路參與微波輻射斂海馬線粒體損傷的病理生理過(guò)程；(3)30mW/cm2微波輻射使PC12細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，ATP含量、SDH和COX活性及AtFm下降，ROS堆積；(4)30mW/cm2微波輻射可使PC12細(xì)胞HIF-Ia表達(dá)呈升高、降低再升高的波動(dòng)性改變，其mRNA呈短暫升高，p-ERKl/2表達(dá)升

17、高。表明微波輻射可激活HIF-la和通過(guò)活化p-ERKl/2激活ERK通路。HIF-1的靶基因VEGF和能量代謝相關(guān)基因COX I和Ⅳ與H/F-1a的表達(dá)變化呈現(xiàn)一致性，表明上述基因表達(dá)參與微波輻射致線粒體損傷過(guò)程；(5) U0126抑制ERK通路，可引起30mW/cm2微波輻射后PC12細(xì)胞p-ERKl/2和HIF-la表達(dá)下降，ATP含量下降和△臥n降低，表明微波輻射后ERK信號(hào)通路正向調(diào)控HIF-la，ERK信號(hào)通路在微波輻射致線