異氟醚引起APP-PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶損傷的神經(jīng)源性炎癥機制研究.pdf

1、目的：采用具有學習記憶損傷的阿爾茨海默氏病模型小鼠 APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以APP/PSEN1小鼠及同窩對照野生型（wild type, WT）小鼠為工具，通過長時程異氟醚（isoflurane, ISO）吸入處理方式，研究異氟醚吸入對阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer＇s disease, AD）模型小鼠疾病進展過程中不同時期學習記憶能力、腦內(nèi)病理改變及伴隨不同時期學習記憶損傷時異氟醚對腦內(nèi)炎癥細胞及神經(jīng)前體細胞增殖的影響

2、，研究異氟醚APP/PSEN1小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活表型的影響，探討異氟醚調(diào)控腦內(nèi)不同炎癥狀態(tài)變化參與調(diào)節(jié)學習記憶損傷的過程，為AD等神經(jīng)源性炎癥相關疾病及老齡化患者的臨床麻醉用藥安全性提供更多的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過新奇物體識別實驗、Morris水迷宮實驗評價異氟醚處理對4、6、10月齡（發(fā)病前、發(fā)病早、中晚期）APP/PSEN1小鼠及對照組 WT小鼠學習記憶能力的影響；實驗共分四組：吸氧處理的野生型小鼠WT

3、+CON組及AD模型小鼠APP/PSEN1+CON組、吸醚處理的野生型小鼠WT+ISO組及AD模型小鼠APP/PSEN1+ISO組。
　　2.行為學實驗結(jié)束后，利用剛果紅染色實驗方法觀察APP/PSEN1小鼠皮層和海馬區(qū)（hippocampus,HIP）淀粉樣斑塊沉積數(shù)目的變化。
　　3.通過免疫熒光實驗方法觀察APP/PSEN1小鼠及其對照組WT小鼠的腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞標志物鈣離子結(jié)合受體蛋白1（ionized calcium

4、-binding receptor adapter molecular1，Iba1）和星形膠質(zhì)細胞標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫反應性變化。
　　4.通過實時定量 PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,）技術(shù)檢測 APP/PSEN1小鼠及對照組 WT小鼠前額葉皮層（prefrontal co

5、rtex, PFC）和海馬區(qū) M1型小膠質(zhì)細胞標志物白介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和M2型小膠質(zhì)細胞標志物幾丁質(zhì)酶3樣蛋白(Chitinase-3 like protein,Ym1/2)的mRNA表達水平的變化。
　　5.通過抗溴脫氧

6、尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine, BrdU）免疫組化實驗方法檢測APP/PSEN1小鼠及對照組WT小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞增殖能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.新奇物體識別實驗中，吸醚處理前，與野生型WT小鼠相比，4月齡 APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠新奇物體識別指數(shù)(RI)無差異，6月齡 APP/PSEN1小鼠RI有下降趨勢（P=0.051），而10月齡APP/PSEN1小鼠RI則顯著降低（P<0.05），提示6

7、月齡 APP/PSEN1小鼠有非空間學習記憶能力損傷的趨勢、10月齡APP/PSEN1小鼠已經(jīng)出現(xiàn)顯著非空間學習記憶能力損傷。隨后對不同月齡兩組小鼠分別進行長時程的吸氧和吸醚處理。新奇物體識別實驗結(jié)果顯示，與經(jīng)吸氧處理的WT小鼠(WT+CON)組相比，4月齡經(jīng)吸醚處理的WT小鼠(WT+ISO)組RI未見明顯差異；與經(jīng)吸氧處理APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PSEN1+CON)組相比，4月齡經(jīng)吸醚處理的APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠(

8、APP/PSEN1+ISO)組 RI未見明顯差異。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示長時程的吸氧和吸醚處理后各組上臺潛伏期和穿臺次數(shù)均無明顯差異。新奇物體識別實驗結(jié)果顯示，與WT+CON組相比，6月齡 APP/PSEN1+CON組 RI顯著降低（P<0.05）；與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡 APP/PSEN1+ISO組 RI明顯降低（P<0.05）；與 WT+CON組相比，6月齡 WT+ISO組 RI未見差異。Morris水迷

9、宮實驗結(jié)果顯示與WT+CON組相比,6月齡APP/PSEN1+CON組上臺潛伏期升高（P<0.05）、穿臺次數(shù)顯著降低（P<0.01）；與APP/PSEN1+CON組相比，APP/PSEN1+ISO組穿臺次數(shù)明顯降低（P<0.01）；與WT+CON組相比，6月齡WT+ISO組穿臺次數(shù)未見差異。新奇物體識別實驗結(jié)果顯示與 WT+CON組相比，10月齡 APP/PSEN1+CON組 RI顯著降低（P<0.05）；與WT+CON組相比， WT

10、+ISO組RI顯著降低（P<0.05）；與APP/PSEN1+CON組相比，10月齡APP/PSEN1+ISO組RI未見差異。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示與WT+CON組相比，10月齡APP/PSEN1+CON組上臺潛伏期顯著升高（P<0.01）、穿臺次數(shù)顯著降低（P<0.001）；與WT+CON相比， WT+ISO組穿臺次數(shù)顯著降低（P<0.01）；與APP/PSEN1+CON組相比，10月齡APP/PSEN1+ISO組穿臺次數(shù)未見

11、差異。行為學實驗結(jié)果提示長時程異氟醚吸入加重發(fā)病早期6月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠空間及非空間學習記憶損傷，對發(fā)病中晚期10月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶損傷不明顯；同時，吸醚加重正常10月齡野生型WT小鼠學習記憶損傷，對4月齡及6月齡正常WT小鼠學習記憶損傷不明顯；
　　2.剛果紅染色實驗中，長時程吸醚處理后，與 APP/PSEN1+CON組相比，6、10月齡APP/PSEN1+ISO小鼠皮層、海馬區(qū)剛果紅染色陽性

12、的淀粉樣斑塊未見顯著變化，提示異氟醚吸入對APP/PSEN1小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積無影響；
　　3.免疫熒光實驗中，吸醚處理后，星型膠質(zhì)細胞標志物GFAP免疫反應結(jié)果顯示，與WT+CON組相比，6、10月齡APP/PSEN1+CON組皮層區(qū)GFAP免疫熒光強度顯著增強（P<0.01，P<0.001），海馬區(qū)有增強趨勢；與WT+CON組相比，6、10月齡WT+ISO組小鼠皮層及海馬區(qū)GFAP免疫熒光強度無變化（P>0.05）；與AP

13、P/PSEN1+CON組相比，6、10月齡 APP/PSEN1+ISO組小鼠皮層及海馬 GFAP免疫熒光強度無變化（P>0.05），提示吸醚處理對星形膠質(zhì)細胞激活程度可能無顯著影響。小膠質(zhì)細胞標志物Iba1免疫反應結(jié)果顯示，與WT+CON組相比，6、10月齡APP/PSEN1+CON組小鼠皮層、海馬區(qū)內(nèi)Iba1免疫熒光強度顯著增強（P<0.05，P<0.01）；與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠皮

14、層及海馬Iba1免疫熒光強度增強（P<0.05），10月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠皮層及海馬Iba1免疫熒光強度未見明顯變化；與WT+CON組相比，6月齡WT+ISO組小鼠皮層及海馬區(qū)Iba1免疫熒光強度未見明顯變化，10月齡WT+ISO組小鼠皮層及海馬區(qū)Iba1免疫熒光強度顯著增強（P<0.05），提示長時程吸醚處理顯著調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞激活程度；
　　4.通過RT-qPCR實驗，長時程吸醚處理后，與WT+CON組小鼠相比，

15、6、10月齡APP/PSEN1+CON組小鼠PFC、海馬內(nèi)IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表達水平有不同程度升高。與 APP/PSEN1+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠海馬腦區(qū)TNF-α、iNOS的mRNA表達水平顯著升高（P<0.01，P<0.05），IL-6mRNA表達水平有升高的趨勢，在PFC有類似增加的趨勢；與WT+CON組相比，6月齡WT+ISO組PFC、海馬內(nèi)IL-6、TNF-α、iNOS mR

16、NA表達水平未見明顯差異。與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠PFC、海馬腦區(qū)M2型小膠質(zhì)細胞標志物Ym1/2的mRNA表達水平各組間無顯著差異，結(jié)果提示長時程吸醚處理促進6月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)炎性因子表達水平增高，但對小膠質(zhì)細胞功能表型轉(zhuǎn)化無顯著影響。與WT+CON組相比，10月齡WT+ISO組小鼠PFC內(nèi)TNF-α的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）， IL-6 mRNA表

17、達水平有升高的趨勢；與WT+CON組相比，10月齡WT+ISO組小鼠海馬腦區(qū)內(nèi) IL-6 mRNA表達水平顯著升高（P<0.01），TNF-α的mRNA表達水平有升高的趨勢。與 WT+CON組相比，10月齡 WT+ISO小鼠PFC腦內(nèi)M2型小膠質(zhì)細胞標志物Ym1/2 mRNA表達水平顯著下降（P<0.01），海馬腦區(qū)有類似的下降趨勢，提示長時程異氟醚吸入誘導10月齡野生型WT小鼠學習記憶損傷可能與吸醚后促進10月齡WT小鼠腦內(nèi)炎性因子釋

18、放，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞M2/M1型功能表型的轉(zhuǎn)化密切相關；
　　5.BrdU免疫組化實驗中，吸醚處理后，與WT+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+CON組小鼠BrdU染色陽性細胞數(shù)目無顯著差異（P>0.05），10月齡 APP/PSEN1+CON組小鼠 BrdU染色陽性細胞數(shù)目顯著減少（P<0.001）。與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡組APP/PSEN1+ISO組小鼠BrdU染色陽性細胞數(shù)目顯著減少（P<0.05）；

19、與WT+CON組相比，10月齡WT+ISO組小鼠BrdU染色陽性細胞數(shù)目有減少趨勢。提示異氟醚導致6月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠及10月齡WT小鼠海馬神經(jīng)前體細胞增殖能力損傷。
　　結(jié)論：長時程異氟醚吸入誘導發(fā)病早期APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠的前額葉皮層相關非空間學習能力及海馬依賴的空間學習記憶能力損傷，對發(fā)病中晚期 APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力損傷并不明顯，加重10月齡正常野生型小鼠學習記憶損傷。研究發(fā)現(xiàn)異氟醚