Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、PLCD1是Plcd1基因編碼的蛋白，屬于磷脂酶C家族δ亞型，在磷酸肌醇代謝和Ca2+平衡中發(fā)揮重要作用。我們的目標(biāo)是建立Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合前期本實(shí)驗(yàn)室自主培育的Plcd1缺失小鼠snthr-1Bao，在整體動(dòng)物水平研究Plcd1的生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)從Plcd1表達(dá)載體的構(gòu)建和顯微注射法制備Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠兩個(gè)方面介紹如下：
　　 第一部分pEF6/V5-His-Plcd1真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 目的：擴(kuò)

2、增Plcd1目的基因片段，獲得能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PLCD1融合蛋白的表達(dá)載體。方法：通過RT-PCR方法獲得Plcd1目的片段，將其與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢測及DNA測序，獲得pMD19-T-Plcd1重組質(zhì)粒；以重組質(zhì)粒為模板，通過引物設(shè)計(jì)及PCR方法在Plcd1目的基因兩端引入合適的酶切位點(diǎn)，將純化的PCR產(chǎn)物和pEF6/V5-His-LacZ表達(dá)載體分別進(jìn)行酶切、純化、回收、連接

3、、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再經(jīng)Amp篩選、PCR檢測及DNA測序，獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體；在此基礎(chǔ)上，通過電轉(zhuǎn)染的方法，將pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體導(dǎo)入L929細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光法檢測PLCD1融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增了長2271bp的Plcd1目的片段，將其與pMD19-T載體連接獲得了pMD19-T-Plcd1克隆載體；以克隆載體為模板，通過PCR方法分別在Plcd1目的基因上下

4、游引入了SpeI和BstBI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物與pEF6/V5-His-Lac Z經(jīng)酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選及測序等一系列步驟，最終獲得了pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體；電轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞后，經(jīng)間接免疫熒光法檢測到PLCD1融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增了全長2271bp的Plcd1目的片段，并先后構(gòu)建了pMD19-T-Plcd1克隆載體及能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白的pEF6/V5-His-Plc

5、d1表達(dá)載體。
　　 第二部分顯微注射法制備Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 目的：在成功獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，通過顯微注射法獲得Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠。方法：pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體經(jīng)酶切、電泳、純化后，選擇包括hEF-1α啟動(dòng)子、Plcd1目的片段、V5、His-tag和BGH的線性構(gòu)件用于顯微注射；供體、受體小鼠經(jīng)同步發(fā)情或超排卵處理，采集受精卵用于顯微注射；經(jīng)顯微注射

6、后的受精卵適當(dāng)培養(yǎng)，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行受體小鼠的輸卵管移植；出生小鼠經(jīng)基因組DNA提取及PCR檢測，初步確認(rèn)獲得Founder轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果：pEF6/V5-His-Plcd1經(jīng)NruI和AseI雙酶切純化后，成功獲得了用于顯微注射的目的片段；顯微注射共681枚受精卵，經(jīng)培養(yǎng)后多數(shù)溶解，僅存活優(yōu)質(zhì)胚胎393枚，存活率為57.7％；存活胚胎全部用于移植，共移植了18只受體小鼠，13只小鼠懷孕，獲得82只仔鼠。經(jīng)PCR初步檢測，成功獲得了1