干擾素刺激基因ISG20的真核表達及其抗乙型肝炎病毒作用與機制研究.pdf

1、本文對干擾素刺激基因ISG20的真核表達及其抗乙型肝炎病毒作用與機制進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：干擾素刺激基因ISG20的真核表達及其抗乙型肝炎病毒作用的研究。
　　目的：ISG20因可由IFN誘導生成被發(fā)現，是除經典的IFN效應蛋白外的又一重要效應因子，具有核酸外切酶的活性，多項研究證明其具有廣泛抗病毒的作用，本部分研究擬體外驗證其抗HBV作用，及該作用是否與其核酸外切酶活性相關。
　　方法：選取

2、穩(wěn)定轉染了HBV并能在上清表達病毒標志物的肝癌細胞系HepG2.2.15細胞，體外構建野生型及失去核酸外切酶活性的突變型ISG20過表達細胞模型，以驗證ISG20的體外抗HBV作用，探討其抗 HBV作用是否與核酸外切酶活性相關，同時為進一步證實ISG20抗HBV活性與其核酸外切酶活性的相關性，比較了轉染無核酸外切酶活性 ISG20的細胞組與空載體組經 IFNα處理后，細胞上清液HBV病毒標志物的表達情況。
　　結果：與突變型和對照

3、組相比，轉染了野生型 ISG20的細胞組上清液病毒標志物表達水平下降，差異存在統(tǒng)計學意義；而在預先用IFNα處理的轉染無核酸外切酶活性ISG20細胞組與對照組中，IFNα的抗HBV活性在無核酸外切酶活性ISG20過表達組受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：野生型ISG20對HBV病毒復制具有抑制作用，且這種作用與其核酸外切酶活性密切相關，而無核酸外切酶活性的ISG20對 IFNα的抗HBV作用有負性調節(jié)的作用。
　　第二

4、部分：干擾素刺激基因ISG20抑制乙型肝炎病毒復制作用機制的初步探索。
　　目的：ISG20最早因IFN誘導產生被發(fā)現，作為其效應蛋白之一，可在PKR、2ˊ5ˊOAS/RNaseL、Mx三重基因缺陷的情況下，仍表現出活躍的抗病毒活性，IFN誘導ISG20產生由其啟動子序列特異的ISRE結構位點介導，此外，ISG20啟動子中還包含有NF-κB的結合位點，可由dsRNA直接誘導經由NF-κB位點啟動抗病毒反應,因此，本研究擬探索 IS

5、G20抗 HBV作用的可能機制是否與啟動子區(qū)域 ISRE和NF-κB的結合位點相關。
　　方法：聯(lián)合JAK1/JAK2高選擇性通路抑制劑Ruxolitinib和NF-κB通路抑制劑BAY11-7082，對穩(wěn)定轉染HBV的肝癌細胞系進行處理，檢測各組細胞通路下游信號分子的表達水平及明確 ISG20的表達在各組是否存在差異。
　　結果：使用兩種不同濃度的特異性 JAK1/JAK2抑制劑 Ruxolitinib處理HepG2.2.

6、15細胞，結果表明，經Ruxolitinib處理的細胞，其p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達水平下降，表明抑制劑在細胞中發(fā)揮作用， IFN處理組 ISG20的表達水平與對照組相比較高，且差異有統(tǒng)計學意義，證實IFN誘導ISG20表達的作用；同時IFN處理組與IFN+Ruxolitinib處理組相比，ISG20的表達水平較高，差異有統(tǒng)計學意義，對照組與Ruxolitinib處理組相比，ISG20的表達水平較高，差異同樣有統(tǒng)計學意義，表

7、明抑制劑處理后，ISG20的表達水平下降。使用兩種不同濃度特異性的 NF-κB抑制劑 BAY11-7082處理HepG2.2.15細胞，所得結果相似，結果表明，p-NF-κB、p-IκBa蛋白表達在BAY11-7082處理組下降，表明抑制劑在細胞中發(fā)揮作用；對照組，BAY11-7082處理組兩組細胞ISG20蛋白及mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義,提示特異性的NF-κB抑制劑BAY11-7082作用于HepG2.2.15細胞后對ISG2