miR-129-5p在椎間盤退變中的作用及其表觀遺傳調(diào)控研究.pdf

1、椎間盤退變影響因素眾多,而其細胞外基質(zhì)的改變,尤其是Ⅱ型膠原的減少和Ⅰ型膠原的增加被認為是椎間盤退變的顯著特點之一。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)microRNA在椎間盤退變的機制中發(fā)揮著重要的作用,針對退變椎間盤組織的microRNA芯片檢測提示miR-129-5p在退變椎間盤髓核組織中出現(xiàn)異常下調(diào)。生物信息學方法預測COL1A1 mRNA(Ⅰ型膠原基因)和ITGA1 mRNA(整合素α1基因)為miR-129-5p的潛在靶基因。椎間盤退變時髓核

2、中Ⅰ型膠原增多的分子機制尚不明確,而整合素α1又是Ⅰ型膠原于髓核細胞上的受體。miR-129-5p作為同時調(diào)控配體(Ⅰ型膠原)和受體(整合素α1)的關鍵分子,在椎間盤退變進程中勢必發(fā)揮著重要的作用。本研究在明確了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1在退變及正常椎間盤髓核組織內(nèi)的表達分布差異后,分別通過體外實驗驗證 miR-129-5p對 COL1A1及ITGA1的直接調(diào)控作用,通過體內(nèi)調(diào)控miR-129-5p觀察其對退變模型病

3、理進程的影響;并且進一步驗證了 miR-129-5p可能的上游表觀遺傳學調(diào)控機制。本研究以miR-129-5p作為中心環(huán)節(jié),構筑了相對完整的椎間盤退變miR-129-5p調(diào)控機制,在椎間盤退變領域提出了全新的退變機制學說,并詳細闡明了其上下游調(diào)控機制。整個研究分為以下四個實驗:
　　實驗一人體髓核組織中miR-129-5p及COL1A1、ITGA1表達量的研究
　　背景及目的:我們前期microRNA芯片檢測提示miR-12

4、9-5p在退變椎間盤髓核組織中出現(xiàn)異常下調(diào)。生物信息學方法預測COL1A1 mRNA(Ⅰ型膠原基因)和ITGA1 mRNA(整合素α1基因)為miR-129-5p的潛在靶基因,Ⅰ型膠原的增加被認為是椎間盤退變的顯著特點之一,而整合素α1作為Ⅰ型膠原于髓核細胞上的受體,其在椎間盤退變進程中的作用尚無報道。要想探明上述三者在椎間盤退變進程中的作用,本部分實驗首先探索了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1 mRNA及其編碼的蛋白在退

5、變及正常椎間盤髓核組織的表達分布差異。
　　方法:收集正常尸體及退變患者的椎間盤髓核組織,用實時定量PCR方法檢測其miR-129-5p、COL1A1及ITGA1 mRNA的表達豐度差異,用天狼猩紅染色方法觀察其膠原的分布差異,用 HE染色方法觀察其病理學差異,用免疫熒光染色方法和westen blot方法觀察其Ⅰ型膠原及整合素α1表達和分布的差異,用熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標方法觀察其miR-129-5p與Ⅰ型膠原及整合素α

6、1的共表達情況。
　　結果:天狼猩紅染色結果提示退變髓核組織Ⅱ型膠原被Ⅰ型膠原取代,椎間盤髓核組織中miR-129-5p下調(diào),同時ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白均出現(xiàn)上調(diào),熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標結果提示miR-129-5p陽性細胞Ⅰ型膠原及整合素α1表達陰性,反之亦然。
　　結論:在髓核組織中,miR-129-5p的表達與ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白表達呈現(xiàn)負向調(diào)控趨勢。

7、　　實驗二 miR-129-5p對COL1A1、ITGA1表達調(diào)控的體外研究
　　背景及目的:通過實驗一我們發(fā)現(xiàn)了在髓核組織中,miR-129-5p的表達與ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白表達呈現(xiàn)負向調(diào)控趨勢,然而在退變髓核組織中miR-129-5p和COL1A1及ITGA1的表達差異是由于兩者間的直接作用導致還是通過某些特定的中間信號通路導致呢?生物信息學方法預測,COL1A1及 ITGA1 mRNA的3’UTR

8、存在與miR-129-5p的潛在結合位點,這為我們研究miR-129-5p直接調(diào)控COL1A1及 ITGA1 mRNA提供了理論依據(jù)。本部分實驗旨在探索 miR-129-5p對COL1A1及ITGA1 mRNA的直接調(diào)控作用,及其對細胞生物學功能的影響。
　　方法:通過雙熒光素酶報告基因方法檢測 miR-129-5p對 ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,用慢病毒轉染原代培養(yǎng)的髓核細胞,上調(diào)/下調(diào)其miR-12

9、9-5p的表達,用western blot方法檢測對COL1A1及ITGA1的表達影響;用實時定量PCR方法確認骨肉瘤細胞系MG-63及U-2 OS中有miR-129-5p的表達后,用慢病毒轉染MG-63及U-2 OS,上調(diào)/下調(diào)其miR-129-5p的表達用細胞劃痕實驗及Trans-well實驗檢測其對細胞功能學的影響。
　　結果:ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR是miR-129-5p的直接作用靶點,上調(diào)/下調(diào)miR

10、-129-5p的表達后,原代培養(yǎng)的髓核細胞中COL1A1及ITGA1的表達呈現(xiàn)出相應的下調(diào)/上調(diào)改變。細胞劃痕實驗提示上調(diào)miR-129-5p表達組U-2 OS及MG-63細胞劃痕愈合速度明顯快于下調(diào)組。Trans-well實驗提示上調(diào)miR-129-5p表達組U-2 OS及 MG-63細胞遷移和侵襲能力明顯上升;下調(diào) miR-129-5p表達組 U-2 OS及MG-63細胞遷移和侵襲能力明顯下降。
　　結論:miR-129-5p

11、通過與其靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,影響靶蛋白CollagenⅠ和Integrinα1的表達,從而引起細胞功能學的改變。
　　實驗三 miR-129-5p對COL1A1、ITGA1表達調(diào)控的體內(nèi)研究
　　背景及目的:通過實驗一及實驗二我們確證了miR-129-5p對其靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,然而體外培養(yǎng)的細胞成分簡單,條件可控性好,影響因素單一,與活體條

12、件下椎間盤組織的細胞微環(huán)境相差甚遠。本部分實驗旨在利用C57小鼠椎間盤退變模型,觀察體內(nèi)調(diào)控miR-129-5p對椎間盤退變病理進程的影響。
　　方法:用實時定量PCR方法確認C57小鼠體內(nèi)miR-129-5p的表達豐度后,用鼠尾穿刺法造成 C57小鼠椎間盤退變模型,分別于造模后通過腺相關病毒轉染,上調(diào)或下調(diào)miR-129-5p在椎間盤的表達,通過western blot檢測轉染后3、6、12w個時間點小鼠椎間盤CollagenⅠ

13、及Integrinα1的表達變化,通過椎間隙高度指數(shù),組織學評分,熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標方法觀察各時間節(jié)點對小鼠椎間盤退變程度的差異。
　　結果:造模后3、6、12周,CollagenⅠ及Integrinα1的表達隨著時間持續(xù)上升,上調(diào)/下調(diào)miR-129-5p可以降低/增加各時間節(jié)點CollagenⅠ及Integrinα1的表達;上調(diào) miR-129-5p可以時間節(jié)點椎間隙高度指數(shù)及組織學評分明顯優(yōu)于下調(diào)miR-129-

14、5p組及陽性對照組。
　　結論:miR-129-5p在體內(nèi)試驗中表現(xiàn)出對椎間盤退變的保護作用,下調(diào)miR-129-5p可以使椎間盤退變程度增加。
　　實驗四 miR-129-5p表觀遺傳學調(diào)控機制的研究
　　背景及目的:實驗一到實驗三通過了體外及體內(nèi)驗證,闡明了miR-129-5p對其下游靶基因靶蛋白的調(diào)控機制。然而其上游的調(diào)控機制尚不明確。本部分實驗旨在探索miR-129-5p上游的調(diào)控機制。
　　方法:取正常

15、對照組及退變組髓核組織各5例,針對miR-129-5p前體miR-129-1及miR-129-2啟動子10kb范圍內(nèi)存在的4個CpG島行甲基化DNA免疫共沉淀-實時定量 PCR(MeDIP-PCR)檢測,在體外培養(yǎng)的原代髓核細胞中,用 DNA甲基化抑制劑5-Aza-2’-deoxycytidine(5Aza-CdR)處理后通過qRT-PCR檢測其對miR-129-5p及其下游靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA的表達調(diào)控作用。

16、>　　結果:定位于miR-129-2 chr11:43596990-43597336及chr11:43602545-43603215的的兩個CpG位點DNA甲基化程度在退變椎間盤中明顯上調(diào)(P<0.05),體外培養(yǎng)的原代髓核細胞經(jīng)過5Aza-CdR處理后 miR-129-5p表達上調(diào),ITGA1和COL1A1 mRNA表達下調(diào)。
　　結論:miR-129-5p在椎間盤退變進程中的異常下調(diào)與其前體pre-miR-129-2定位于ch