17β-雌激素調(diào)控大鼠髓核細(xì)胞自噬在椎間盤退變中作用的研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討在17β-Estradiol處理下髓核細(xì)胞中自噬與凋亡的關(guān)系及二者在椎間盤退變中的作用。
　　方法：
　　（1）體外分離培養(yǎng)SD大鼠髓核細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，甲苯胺藍(lán)、阿利新藍(lán)染色及II膠原蛋白免疫組化染色鑒定原代培養(yǎng)的細(xì)胞類型。
　?。?）予于血清剝奪12、24、48、72H來(lái)誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡和自噬，然后用MDC染色、Annexin V-FITC/PI熒光染色法和

2、Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、自噬和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平變化，確立血清剝奪所致髓核細(xì)胞退變的最佳作用時(shí)間。
　　（3）加入17β-Estradiol并使其在培養(yǎng)液內(nèi)的最終濃度分別為10-11、10-9、10-7M，隨后使用Western blotting檢測(cè)髓核細(xì)胞內(nèi)自噬水平改變以及凋亡蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)情況。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度17β-Estradiol作用下的髓核細(xì)胞的凋亡率變化情況。

3、>　?。?）應(yīng)用自噬抑制劑預(yù)處理髓核細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting方法、mCherry-GFP-LC3-adenovirus轉(zhuǎn)染觀察17β-Estradiol與血清剝奪誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系和可能存在的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。?）分離培養(yǎng)的SD大鼠髓核細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察大多呈多角形。正常髓核細(xì)胞大多數(shù)為圓形或橢圓形，可見多個(gè)核仁；經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后胞漿呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色；阿

4、爾新藍(lán)染色后細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色；Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色見細(xì)胞質(zhì)黃色，細(xì)胞核周圍散在棕黃色顆粒。
　?。?）在血清剝奪處理下大鼠髓核細(xì)胞凋亡的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組并呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)，自噬的表達(dá)水平也明顯升高，但是在作用48h之后開始下降。
　?。?）10-7 M17β-Estradiol能夠顯著提高血清剝奪48小時(shí)誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞自噬并減少凋亡。
　?。?） Western blot分析表明，當(dāng)預(yù)先使用自噬抑制劑3-MA處理細(xì)

5、胞1h后再加入17β-Estradiol與細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Beclin-1和LC3-II/Ⅰ的表達(dá)被明顯抑制，而蛋白cleaved caspase-3、MMP-3、MMP-13的表達(dá)卻顯著增加。流式細(xì)胞儀分析顯示的結(jié)果與Western blot一致，加入3-MA后細(xì)胞凋亡率明顯升高。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)mCherry-GFP-LC3-adenovirus轉(zhuǎn)染的自噬泡10-7 M的17β-Estradiol組明顯高于10-7 M的17β-E