海洋弧菌QY104的褐藻膠裂解酶AlyV4的研究.pdf

1、褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁和一些細(xì)菌生物被膜的主要成分。它是一種線性的多聚糖，由兩種糖單元β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)通過α或β-1，4糖苷鍵連接而成。褐藻膠一般有三種結(jié)構(gòu):由β-D-甘露糖醛酸組成的多聚甘露糖醛酸片段，即polyM;由α-L-古羅糖醛酸組成的多聚古羅糖醛酸片段，即polyG;由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸隨機(jī)排列組成的MG交替片段。褐藻膠被廣泛應(yīng)用于許多工業(yè)領(lǐng)域，褐藻寡糖也被發(fā)現(xiàn)具有很多生物活性

2、。
　　褐藻膠裂解酶通過β消去機(jī)制降解褐藻膠，產(chǎn)生非還原端不飽和的褐藻膠寡糖。褐藻膠裂解酶具有多種用途，如降解褐藻膠產(chǎn)生寡糖、治療CF病人纖維化肺病、制備海藻原生質(zhì)體等。
　　本文從海水、海泥和腐爛的海藻中分離到13株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株。底物專一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株QY104產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶偏好降解polyG片段。通過對菌株QY104的16S rRNA序列分析，鑒定該菌屬于弧菌屬。
　　弧菌QY104的發(fā)酵上清經(jīng)

3、過硫酸銨沉淀、疏水作用層析和離子交換層析后，分離得到褐藻膠裂解酶AlyV4。SDS-PAGE電泳分析顯示其分子量大小為33kDa。對褐藻膠裂解酶AlyV4性質(zhì)研究后發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為7.6，褐藻膠裂解酶在pH7.0-10.6以及45℃以下范圍內(nèi)穩(wěn)定。氯化鈉可以大幅度提高該酶的活性，并對其熱穩(wěn)定性具有重要影響。AlyV4的活性幾乎被Cu2+、Fe3+和EDTA完全抑制，F(xiàn)e2+、Al3+、Ba2+、Ni2+、Zn

4、2+、Mn2+和SDS對其活性具有不同程度的抑制作用。對降解產(chǎn)物進(jìn)行FACE電泳分析表明，褐藻膠裂解酶AlyV4降解polyG片段后產(chǎn)生二糖、三糖和四糖，降解褐藻膠后產(chǎn)生二糖、三糖、四糖和五糖。
　　根據(jù)褐藻膠裂解酶AlyV4的蛋白質(zhì)序列信息，通過簡并PCR和SiteFindingPCR克隆到該酶的編碼基因alyV4。其包含1359 bp的開放閱讀框，共編碼452個(gè)氨基酸序列，理論分子量為50 kDa，理論等電點(diǎn)為4.6。序列分析

5、顯示褐藻膠裂解酶AlyV4屬于多糖裂解酶第7家族（PL-7），和Saccharophagus sp.Myt-1編碼的一個(gè)褐藻膠裂解酶同源性最高，達(dá)到63％。褐藻膠裂解酶基因alyV4編碼的蛋白質(zhì)包含信號肽序列、N末端碳水化合物結(jié)合序列和C末端褐藻膠裂解酶催化區(qū)，分離純化到的褐藻膠裂解酶AlyV4只是其蛋白質(zhì)序列中的催化區(qū)部分。
　　成功構(gòu)建了三種重組表達(dá)載體，分別編碼AlyV4的全序列(AlyV4-SNC)、AlyV4的去信號肽序

6、列(AlyV4-NC)及AlyV4的催化區(qū)(AlyV4-C)。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD600約0.5左右，加入終濃度1 mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)20 h。離心收集菌體，超聲破碎后，使用Ni親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行了分離純化。對酶學(xué)性質(zhì)研究顯示，重組酶AlyV4-C和從野生菌中分離純化到的褐藻膠裂解酶AlyV4性質(zhì)基本一致，但與重組酶AlyV4-C的性質(zhì)具有一定的差異。重組酶AlyV4-NC在4℃存放