

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、瓊膠酶是一種能夠降解瓊膠,生成瓊膠寡糖的糖苷水解酶。近年來,隨著糖生物學的深入研究,人們發(fā)現瓊膠寡糖尤其是新瓊寡糖在誘導細胞調亡、抗氧化、抗炎、促進雙歧桿菌生長、預防糖尿病等方面具有顯著的生理活性,因此可廣泛應用在食品、飼料、化妝品和醫(yī)藥領域。瓊膠寡糖制備方面,傳統(tǒng)的化學酸解法方法存在著反應條件難控制、降解產物不純等問題,而酶解法則有底物專一性強、產物特異性高、反應條件溫和等優(yōu)點,因此對瓊膠酶的研究具有重要意義。本文以本實驗室分離得到的
2、海洋細菌HQM9T為主要研究對象,完成了其新種鑒定、發(fā)酵產酶條件優(yōu)化以及瓊膠酶基因的克隆表達等工作。
海洋細菌HQM9T分離自生長在威海海域的收集的石花菜表面,是一株具有很強瓊膠降解能力細菌,在2216E平板上培養(yǎng)3-5天可完全液化平板。HQM9T的呼吸醌類型是MK-6,主要脂肪酸類型是C15∶0iso,C17∶0iso3OH,C16∶1w7c/15iso2OH,C16∶03OH,C16∶0,C17∶02OH,C14∶0,C1
3、3∶1AT12-13,C13∶0iso.主要的極性脂包括磷脂酰乙醇胺和一種未知的脂質?;蚪MDNA(G+C)含量是33.20mol%。16SrDNA的測序結果表明該菌屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)黃桿菌綱(Flavobacteria)黃桿菌科(Flavobacteriaceae),與該科中明確鑒定到種的AquimarinaagarilyticaZCI有最大相似性,為97.09%,可以初步判別為Aquimarina屬的新種,命
4、名為噬瓊膠海水菌Aquimarinaagarivorans,16SrRNA基因序列的GenBank收錄號是HQ593612.本文對其發(fā)酵產酶的條件進行了優(yōu)化,前期研究實驗確定了其發(fā)酵產酶的基本條件:最適鹽度25‰,初始pH為8.0,附加碳源為瓊脂,氮源為蛋白胨。在此基礎上我們對培養(yǎng)基瓊脂、蛋白胨、酵母粉的添加量,裝瓶量,接種量,發(fā)酵溫度,發(fā)酵時間等設計七因素三水平的正交實驗(L1837),獲得該菌產瓊膠酶的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件為:瓊
5、脂0.5%,蛋白胨0.6%,酵母粉0.08%,NaC125‰,初始pH8.0,裝瓶量50ml(250ml三角瓶),溫度28℃,接種量0.1%情況下,150rpm/min培養(yǎng)發(fā)酵72h測得最大酶活,可穩(wěn)定在35U.ml-1左右,較優(yōu)化前提高了大約2倍。
為了更好地對細菌HQM9T的瓊膠酶進行研究,對其全基因組進行了測序。將HQM9T全基因組測序結果與相關蛋白數據庫(包括KEGG,Swissprot,Uniprot等)中已知瓊膠酶
6、基因進行比對,發(fā)現該菌株含有36個預測的瓊膠酶基因,其中19個屬于GH16家族,其余的不屬于已知家族,基因長度從309bp-5217bp,表明菌株及其瓊膠酶具有新穎性。對HQM9T發(fā)酵后的粗酶液進行活性電泳檢測,結果表明在HQM9T的粗酶液能夠檢測到瓊膠酶組分。質譜鑒定的分析結果表明這七個酶組分分別為基因aga16A,aga161,aga16L,aga16S,aga16AB,aga16AD,agaAJ編碼的瓊膠酶,其分子量大小分別為96
7、.68kDa,128.19kDa,72.91kDa,98.88kDa,44.35kDa,57.61kDa,73.98kDa。
選取pET原核表達系統(tǒng)對質譜鑒定的7個瓊膠酶基因進行克隆表達。將此七條基因連入pET-24a(+)原核表達載體,轉入宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)中構建重組菌株。經過IPTG誘導后,SDS-PAGE檢測表明轉入基因aga16AD的重組表達菌株有大量符合預期大小的蛋白表達,且在菌體
8、破碎上清中能夠檢測到瓊膠酶活性,其他的重組菌株未有明顯蛋白的表達。通過鎳離子親和層析,對重組瓊膠酶進行分離純化,SDS-PAGE檢測為電泳純。對純化之后的重組酶的酶學性質進行了檢測分析,發(fā)現重組酶的最適底物濃度為1%,最適溫度為50℃,最適pH為6.0。不同的金屬離子對重組酶的影響不同,Ca2+可以稍微提高重組酶的酶活,K+、Mg2+和Na+對重組酶酶活幾乎無任何影響,而Zn2+、Mn2、+Cu2+、Co2+和Pb2+等重金屬離子,對重
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 181.海洋瓊膠降解細菌的篩選、鑒定及其瓊膠酶研究
- 三株海洋新菌的鑒定及細菌017T和TS1T的瓊膠酶研究.pdf
- 海洋瓊膠降解細菌的多樣性研究與Agarivorans albus QM38 β-瓊膠酶基因的克隆與表達.pdf
- 瓊膠酶生產菌的篩選、鑒定及其產酶條件的優(yōu)化.pdf
- 海洋細菌ZC1中GH50家族瓊膠酶的研究.pdf
- 產瓊膠酶菌株的篩選及其酶學性質.pdf
- 41046.高產瓊膠酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及瓊膠酶酶學性質的研究
- 瓊膠低聚糖的酶法制備及其理化性質研究.pdf
- 高產瓊膠酶菌株的選育和產酶的研究.pdf
- 8341.海洋細菌catenovulumsp.x3新型α淀粉酶hp665和β瓊膠酶baq基因克隆、表達及酶學性質研究
- 瓊膠糖降解菌的鑒定和選育及其發(fā)酵產物的研究.pdf
- 14843.嗜瓊膠卵鏈菌β瓊膠酶基因ym013的克隆表達及酶學性質研究
- 瓊膠酶及新瓊寡糖水解酶工業(yè)化應用的初步研究.pdf
- 新型β-瓊膠酶AgaB的定向進化.pdf
- β-瓊膠酶的純化及新瓊二糖水解酶AgWH117A結構的研究.pdf
- 產蛋白酶海洋細菌的篩選及其酶學性質研究.pdf
- 瓊膠酶AgaXa結構與功能關系的初步研究.pdf
- 瓊膠酶的發(fā)酵條件優(yōu)化、表達調控和酶學性質研究.pdf
- 瓊膠酶產生菌株的選育及酶解條件和酶解產物的研究.pdf
- 海洋假別單胞菌CY24的瓊膠酶基因的克隆、重組表達及酶學性質研究.pdf
評論
0/150
提交評論