褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)與褐藻水解產(chǎn)物的應(yīng)用研究.pdf

1、褐藻中含有豐富的褐藻多糖和甘露醇,褐藻經(jīng)過處理之后得到褐藻寡糖和甘露醇。褐藻寡糖和甘露醇在理論上可以被微生物利用生產(chǎn)乙醇。另外,褐藻寡糖還有很多獨特的生理活性,在食品、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等行業(yè)都具有巨大的應(yīng)用前景。酶解法由于其反應(yīng)條件溫和、易控制、產(chǎn)物均一的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用在多糖的水解方面。目前發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌酶產(chǎn)量低,酶活力小;雖然,隨著基因工程的發(fā)展,超過20種褐藻膠裂解酶的基因得到克隆和測序,并構(gòu)建出多種重組褐藻膠裂解酶基因工程菌,

2、但目前所構(gòu)建的重組褐藻膠裂解酶基因工程表達(dá)水平還比較低,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化制備褐藻寡糖的需求。獲得高活性的褐藻膠裂解酶成為制備褐藻膠寡糖的關(guān)鍵步驟。若能提高褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量及酶活力,制備出大量褐藻膠寡糖則在多方面都具有重要的意義。
　　為了提高重組基因工程菌褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量,有必要對基因工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵研究,通過發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)更多的褐藻膠裂解酶。本研究以實驗室構(gòu)建的褐藻膠裂解酶基因工程菌作為菌種,通過改變高密度發(fā)酵過程中

3、的補(bǔ)料策略,提高藻膠裂解酶基因工程菌的菌體密度,從而提供褐藻膠裂解酶的表達(dá)量,提高褐藻膠裂解酶的活性。并利用發(fā)酵后制備的褐藻膠裂解酶制備褐藻寡糖,研究褐藻寡糖的作用;為提高褐藻的有效利用開辟了新的途徑。
　　1.本文在5L發(fā)酵罐中,利用分批補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)含表達(dá)褐藻膠裂解酶重組質(zhì)粒的工程菌 E.coli BL21,生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。利用單因素實驗對補(bǔ)料培養(yǎng)基中碳源濃度進(jìn)行優(yōu)化,利用單因素實驗和單純形優(yōu)化法對誘導(dǎo)時間和IPTG

4、濃度進(jìn)行了優(yōu)化。得到最適高密度發(fā)酵條件為:發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L,酵母提取物5g/L,蛋白胨20g/L;補(bǔ)料培養(yǎng)基為葡萄糖150g/L,蛋白胨20g/L,酵母提取物10g/L,4-10h的流加速率為100mL/h,10-16h的流加速率設(shè)定為200mL/h;誘導(dǎo)時間為4.5h,IPTG終濃度為0.60mmol/L,發(fā)酵過程中溶解氧控制在30％-40%,pH控制在7.0-7.2。IPTG未誘導(dǎo)時,最終發(fā)酵液中菌液稀釋200倍后,OD

5、600達(dá)0.696,菌體濃度達(dá)65.38g/L;IPTG誘導(dǎo)后菌液稀釋200倍后,OD600達(dá)0.457,菌體濃度達(dá)60.15g/L,是分批發(fā)酵的8.43倍;菌體進(jìn)行超聲波破碎后制備粗酶液,酶活力達(dá)26.37U/mL,是分批發(fā)酵的5.48倍。
　　2.通過對影響褐藻膠裂解酶水解褐藻膠效率的5個因素:底物濃度、加酶量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和pH值進(jìn)行單因素及正交實驗,確定了最佳水解條件:pH值6.0水,解溫度50℃,水解時間4h,加酶

6、量45%,底物濃度0.4%。在最優(yōu)水解條件下,利用褐藻膠裂解酶水解褐藻膠制備褐藻寡糖,褐藻寡糖的產(chǎn)量為0.541g/g海藻酸鈉。對褐藻寡糖對雙歧桿菌的增殖作用進(jìn)行研究,結(jié)果表明增殖效果顯著,以褐藻寡糖為碳源的改良MRS培養(yǎng)基平衡期雙歧桿菌體濃度達(dá)到3.09×108cfu/mL,比以葡萄糖為碳源的MRS培養(yǎng)基所得菌體濃度提高3.68倍。
　　3.利用熱帶假絲酵母發(fā)酵甘露醇產(chǎn)乙醇,通過對影響發(fā)酵的5個因素:發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝液量、